類紅球菌酯酶立體選擇性和催化底物譜的改造及產(chǎn)生機(jī)理的研究.pdf

1、羧酸酯酶(EC3.1.1.1)能夠作用于羧酸酯類的酯鍵，催化其水解。它在水解反應(yīng)中具有一定的活性與立體選擇性，并能在有機(jī)溶劑中保持比較好的穩(wěn)定性，所以常應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等行業(yè)中來催化合成一系列重要的化合物。本文從一個鮮有被報道的來源于類紅球菌Rhodobacter sphaeroides的羧酸酯酶基因Rsp_2728出發(fā)，通過分子克隆以及定向進(jìn)化的手段，對該酯酶的立體選擇性和催化底物譜進(jìn)行改造。
　　 利用易錯PCR技術(shù)，

2、對目的基因Rsp_2728進(jìn)行隨機(jī)突變。通過建立靈敏有效的pH指示高通量篩選方法，并以單體扁桃酸甲酯為水解底物，對類紅球細(xì)菌(Rsp)羧酸酯酶的突變文庫進(jìn)行了批量篩選。得到的突變體Rsp酯酶YH(Asn62Tyr，Leu145His)、CH(Asn62Cys，Leu145His)以及CVH（Asn62Cys，Met121Val和Leu145His），其對映體選擇性值相比較于野生型Rsp酯酶的3.13，上升到8.77、14和30.8，分別

3、提高了2.8倍、4.5倍和9.8倍。
　　 對得到的三個對映體選擇性有明顯提高的突變體進(jìn)行了催化底物譜的研究，發(fā)現(xiàn)相比較于上述實(shí)驗(yàn)獲得的最優(yōu)突變體Rsp酯酶CVH，突變體Rsp酯酶CH能夠?qū)Υ蟛糠值孜镞M(jìn)行高選擇性地水解。為了從分子水平上合理解釋上述現(xiàn)象，與其他機(jī)構(gòu)合作開展了該野生型酯酶的蛋白結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，并獲得了具有較高分辨率的X-衍射晶體結(jié)構(gòu)。
　　 基于上述獲得的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，并將分子對接以及分子動力學(xué)模擬相結(jié)合，對定向

4、進(jìn)化與催化底物譜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了研究。分析結(jié)果表明，突變體Rsp酯酶催化扁桃酸甲酯水解時手性選擇性的提高，(1)并不是由位于活性中心的催化三聯(lián)體氨基酸以及氧陰離子洞氨基酸引起的，它們都能與R或S構(gòu)型底物形成起穩(wěn)定作用的氫鍵;(2)也不是由突變位點(diǎn)氨基酸與底物單體的直接分子間作用力的增強(qiáng)而導(dǎo)致的;(3)而是由活性口袋中與底物距離10(A)以內(nèi)的9個氨基酸與底物之間分子間相互作用力的增強(qiáng)而引起的，由野生型時的0.8 kJ/mol上升到了突變

5、體CVH的9.4 kJ/mol?？梢?，突變位點(diǎn)氨基酸能夠通過分子間作用力的傳遞機(jī)制，對立體選擇性的提高做出貢獻(xiàn)。對催化底物譜進(jìn)行構(gòu)象分析表明，突變體Rsp酯酶CH中突變位點(diǎn)氨基酸的引進(jìn)，使得鄰近底物的氨基酸之間的分子間相互作用增強(qiáng)，從而導(dǎo)致了活性口袋的變小，使得兩個構(gòu)象的單體之間競爭更加激烈，從而解釋了它能夠催化大部分底物具高選擇性地水解，并實(shí)現(xiàn)催化底物譜的拓寬。
　　 最后，本文通過研究Rsp酯酶的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)催化特性，得到了該酶