分子改造提高脫氧核糖醛縮酶的催化活性和底物耐受性.pdf

1、2-脫氧-D-核糖醛縮酶(EC4.1.2.4，DERA)催化的羥醛縮合反應(yīng)可以生成兩個(gè)手性中心，特別是它能夠以三分子乙醛為底物，經(jīng)過(guò)兩步連續(xù)羥醛縮合反應(yīng)得到他汀類藥物手性側(cè)鏈。他汀類藥物能夠有效降低人體內(nèi)膽固醇含量，是一種重要的的降血脂藥物。盡管如此，DERA在應(yīng)用上仍存在一些問(wèn)題:底物譜窄，偏好磷酸化底物，對(duì)2-脫氧-D-核糖(DR)等非磷酸化底物催化活力低，對(duì)底物乙醛的耐受性差等。因此本課題在改進(jìn)現(xiàn)有熒光高通量篩選方法的基礎(chǔ)上，對(duì)D

2、ERA進(jìn)行同源模建和分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算，綜合運(yùn)用定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)改造DERA，以提高其對(duì)非磷酸化底物的催化活力和對(duì)高濃度乙醛的耐受性，并用于手性藥物前體的合成。
　　(1)熒光高通量篩選方法的建立:為了快速有效的篩選新酶和測(cè)定改造后DERA的催化活性，在現(xiàn)有熒光高通量篩選方法的基礎(chǔ)上，研究香豆素類衍生物熒光發(fā)光機(jī)制，發(fā)現(xiàn)母環(huán)分子中取代基的種類及其位置的變化能夠?qū)晒鈴?qiáng)度產(chǎn)生作用。通過(guò)對(duì)熒光底物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，在香豆素母環(huán)3號(hào)位引

3、入苯并咪唑基，在6號(hào)位引入甲氧基，使底物在可見(jiàn)光下散發(fā)強(qiáng)烈的綠色熒光，相比于現(xiàn)有方法，其檢測(cè)靈敏度提高了58.2倍。
　　(2)DERA的定向進(jìn)化改造:從實(shí)驗(yàn)室前期重組表達(dá)的8種DERA中，選擇對(duì)非磷酸化底物DR催化活力乙醛耐受性最高的DERAGth和DERAsep作為研究對(duì)象。這兩種酶均可在E.coli BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)，純酶的比活分別為22.5U/mg和16.5U/mg。通過(guò)易錯(cuò)PCR對(duì)DERAGth和DERA

4、sep進(jìn)行定向進(jìn)化后，利用構(gòu)建的高通量篩選方法獲得突變株DERAGth(F159I，S209G)，其比活為105.8U/mg，相比原始酶提高了3.7倍。
　　(3)理性設(shè)計(jì)提高DERA對(duì)N-丙烯醛鄰苯二甲酰亞胺的催化活力:考察了DERAGth，DERAsep催化受體底物N-丙烯醛鄰苯二甲酰亞胺(N-AMP)和乙醛縮合這一模型反應(yīng)的活力， DERAGth和DERAGth(F159I，S209G)比活分別為0.52U/mg和0.71

5、U/mg，而DERAsep比活為6.2U/mg，因此選擇DERAsep作為目標(biāo)酶進(jìn)行改造。以DERATma(PDB1oOy)為模板，采用同源建模法構(gòu)建了DERAsep的結(jié)構(gòu)模型，并對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)殘基Thr10，Ser205, Ala206的側(cè)鏈可能阻礙N-APM進(jìn)入催化口袋。根據(jù)對(duì)接能的大小選擇Thr10，Ser205，Ala206進(jìn)行模擬突變，突變體結(jié)合N-AMP的分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算，得到DERAsep(A206G)和

6、DERAsep(S205E)的結(jié)合自由能分別為-12.39kcal/mol和-7.11 kcal/mol(DERAsep為-3.17kcal/mol)，推測(cè)這兩個(gè)位點(diǎn)的突變可能會(huì)引起酶活力的變化。定點(diǎn)突變后考察突變體對(duì)底物催化活力的變化，結(jié)果顯示，DERAsep突變體(A206G)比活為22.8U/mg，比DERAsep提高了2.7倍。
　　(4)理性設(shè)計(jì)提高脫氧核糖醛縮酶乙醛耐受性:以DERAsep和DERAsep(A206G)

7、為研究對(duì)象，根據(jù)研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)酶的熱穩(wěn)定性和其乙醛等有機(jī)溶劑的耐受性有正相關(guān)性，因此提出通過(guò)增強(qiáng)DERAsep的穩(wěn)定性提高其乙醛耐受性的思路。利用分子模擬工作站Discovery Studio對(duì)DERAsep的結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行虛擬突變掃描計(jì)算，得到單個(gè)氨基酸的突變能。基于軟件的運(yùn)算規(guī)則，突變能越低，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，選取七個(gè)突變能最低的單點(diǎn)位點(diǎn)D15F: S16I，T41C，T120I，G174Y，G174，G213C，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行雙點(diǎn)突變和多點(diǎn)

8、虛擬突變，得到的組合突變能最低的突變體DERAsepVariant10(T120C,G174I,G213C)和DERAsep Variant11(T120C,G174I,A206G，G213C)。考察其乙醛耐受性，結(jié)果顯示DERAsepVariant10在300mM乙醛濃度下，靜置2小時(shí)后，活力殘余70.5％，DERAsep Variant11在相同條件下靜置2小時(shí)后，活力殘余66.7％，而被廣泛研究的DERAEco在同樣條件下，靜置2

9、小時(shí)后活力殘余幾乎為0。在全細(xì)胞催化N-AMP(46.2mM)和乙醛(166.7mM)的縮合反應(yīng)中，在24h內(nèi)DERAsep Variant11催化反應(yīng)了43.6％的底物，比DERAsep和DERAEco分別提高了1.32倍和3.1倍，是文獻(xiàn)中報(bào)道的DERA催化活力的1.55倍。
　　(5) DERAEco的固定化改造:通過(guò)交聯(lián)將DERA結(jié)合在納米Fe3O4磁性顆粒上，確定最適的交聯(lián)條件為:酶量與載體量的比為1∶10，交聯(lián)pH為6