蚯蚓體腔液及脫氧核糖核酸酶的抗菌機制研究.pdf

1、目的: 制備蚯蚓體腔液粗提物，檢測粗提物的抗菌活性，確定其最低抑菌濃度和最低殺菌濃度。針對細菌結(jié)構(gòu)逐步研究蚯蚓體腔液的抗菌作用機制。確立蚯蚓脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease，DNase)在蚯蚓固有免疫中的地位，分析蚯蚓DNase對細菌的作用。 方法: 蚯蚓體腔液通過碳酸銨處理、丙酮沉淀等一系列步驟制備出體腔液粗提物。用液體培養(yǎng)基二倍稀釋法測定蚯蚓體腔液粗提物最低抑菌濃度，再將無細菌生長的各培養(yǎng)管

2、中的培養(yǎng)液分別移種在新鮮的瓊脂糖平板上，測定最低殺菌濃度。 通過檢測疏水性熒光探針1-N-pbenyl-naphtylamine(NPN)的熒光強度來測定體腔液對革蘭氏陰性菌外膜的穿透作用。比濁法測定體腔液對肽聚糖的分解作用。用分光光度計監(jiān)測鄰硝基苯酚(ortho-nitrophenol，ONP)的生成，以測定體腔液對細菌內(nèi)膜的透化作用。CATB法提取細菌基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳觀察體腔液降解細菌基因組DNA的活性。用堿裂解

3、法從產(chǎn)ESBL酶肺炎克雷伯菌中提取耐藥質(zhì)粒。瓊脂糖凝膠電泳觀察體腔液降解細菌耐藥質(zhì)粒DNA的活性。 用量化細菌生物膜的標準實驗檢測蚯蚓DNase對生物膜的作用。分析蚯蚓DNase對體腔液的抗菌有無協(xié)同作用。 結(jié)果: 蚯蚓體腔液有明確的抗菌活性。細菌誘導(dǎo)的體腔液的抗菌活性顯著高于沒有細菌誘導(dǎo)的體腔液。在一定時間范圍內(nèi)，體腔液對細菌外膜、內(nèi)膜有時間依賴性穿透作用。體腔液能降解細胞壁中肽聚糖骨架，分解耐藥質(zhì)粒DNA、細

4、菌基因組DNA。蚯蚓DNase在檢測的各時間點均抑制細菌生物膜的形成，對體腔液有協(xié)同抗菌作用。 結(jié)論: 蚯蚓體腔液對細菌有殺滅效應(yīng)，但對各菌株作用有差異，說明體腔液的抗菌作用有選擇性。 蚯蚓體腔液的抗菌機制是通過對生物膜降解，透化細菌的外膜、內(nèi)膜，降解細胞壁中肽聚糖成分，使細菌通透性增高，細菌內(nèi)外物質(zhì)失去平衡，推測蚯蚓DNase透過孔道進入胞漿降解遺傳物質(zhì)，造成細菌的徹底死亡。 蚯蚓DNase是固有免疫中