反向PCR精確定位人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞CD133基因啟動(dòng)子區(qū)脫氧核糖核酸酶Ⅰ高敏感位點(diǎn).pdf

1、目的：
　　利用反向PCR（inverse-PCR）方法精確定位人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞CD133基因啟動(dòng)子區(qū)對(duì)脫氧核糖核酸酶I(DNaseI）酶切敏感位點(diǎn)，探討此方法在研究腫瘤細(xì)胞基因調(diào)控方面應(yīng)用的可行性。
　　方法：
　　以人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480為研究模型，細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)量達(dá)到107時(shí)提取細(xì)胞核，10U/ml DNaseI切割SW480細(xì)胞核中的染色質(zhì)后，按照苯酚/氯仿/異戊醇（10：10：1）方法提取基因組，用限制性

2、內(nèi)切酶EcoRI和XmalI片段化基因組，通過末端補(bǔ)平、T4連接酶連接成環(huán)等過程，利用反向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并將PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連入pMD-18 T載體，轉(zhuǎn)入到大腸桿菌TOP10株中進(jìn)行表達(dá)，篩選陽性克隆進(jìn)行基因測(cè)序。
　　結(jié)果：
　　通過測(cè)序，人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞CD133基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游9個(gè)DNaseI高敏感位點(diǎn)被鑒別出來，它們位于第一個(gè)外顯子-700～-300bp堿基區(qū)域內(nèi)。
　　結(jié)論：
　　應(yīng)用反向P