一種新型的脫氧核糖核酸酶的分離純化、性質(zhì)及免疫功能的研究.pdf

1、蚯蚓核酸酶系本課題組近年來在研究蚯蚓過程中發(fā)現(xiàn)的一組具有抗病毒活性的核酸酶類。初步研究結(jié)果提示，該類酶極具成為新型的、獨(dú)特的、具有高效抗病毒作用的殺滅微生物的中藥生物制劑的良好前景，并有助于人類在發(fā)現(xiàn)和探索新型抗微生物制劑和研究抗病毒制劑的征途上另辟蹊徑。近年來已從該組分純化出三種脫氧核糖核酸酶，并對三種脫氧核糖核酸酶進(jìn)行了理化性質(zhì)、生化表征特征的研究及基因鑒定。肽質(zhì)量指紋圖譜結(jié)果為新蛋白。ELMWD(Earthworm Low mol

2、eoular weight deoxyribonuclease)是本研究在優(yōu)化脫氧核糖核酸酶制備工藝的基礎(chǔ)上通過功能膠新發(fā)現(xiàn)的一種分子量相對較小的脫氧核糖核酸酶。文獻(xiàn)檢索表明，地龍中的核酸酶是本課題組率先發(fā)現(xiàn)并展開研究的，ELMWD是其中的一種。本課題將進(jìn)一步從純化工藝、酶學(xué)性質(zhì)、蛋白表征特征、免疫功能等生物化學(xué)、分子生物學(xué)和分子藥理學(xué)的內(nèi)容進(jìn)行研究。ELMWD的發(fā)現(xiàn)和機(jī)制研究，尚未見其它文獻(xiàn)報道。 研究方法及結(jié)果: 一

3、、蚯蚓組織脫氧核糖核酸酶測活、提取工藝的優(yōu)化及一種小分子量脫氧核糖核酸酶(ELMWD)的純化 (一)蚯蚓脫氧核糖核酸酶測活方法的擴(kuò)充及改進(jìn)。 測活是核酸酶純化工作中最重要的部分，本研究提出了采用兼有分離及監(jiān)測酶種類的SDS-PAGE功能膠測活方法，以DNaseI作為標(biāo)準(zhǔn)品，摸索出了最佳的實(shí)驗(yàn)條件及去除SDS對酶活性的影響方法，為后續(xù)的研究奠定了方法基礎(chǔ)。 (二)蚯蚓脫氧核糖核酸酶層析樣品制備工藝的優(yōu)化。

4、層析樣品的制備是分離純化的前提，課題組前期實(shí)驗(yàn)制備的脫氧核糖核酸酶層析樣品具有雜蛋白、粘蛋白及色素較多的缺點(diǎn)，影響了后續(xù)層析分離過程，針對上述三點(diǎn)本研究提出了三條工藝路線并進(jìn)行驗(yàn)證。與前期層析樣品制備的主要區(qū)別在于探索了碳酸銨抽提、熱變性、丙酮分級沉淀、純丙酮洗滌、硫酸銨分級沉淀及酸變性等處理因素。采用SDS-PAGE功能膠和瓊脂糖凝膠電泳法監(jiān)測酶的種類及活性的變化情況；以脫氧核糖核酸酶活性與種類的保留、粘性物質(zhì)、雜蛋白的去除為主要目標(biāo)

5、，比較不同處理方法的結(jié)果。 結(jié)果在SDS-PAGE功能膠監(jiān)測的過程中發(fā)現(xiàn)了兩組電泳遷移率不同的脫氧核糖核酸酶，這兩組脫氧核糖核酸酶對不同的處理因素耐受情況不同，針對這兩組遷移率不同的脫氧核糖核酸酶分別提出了兩套不同的分離純化路線。大分子量組采用機(jī)械勻漿、碳酸銨抽提、60℃，10min熱變性、pH3.8丙酮分級沉淀(或者pH4.6丙酮50％一次性沉淀)的工藝路線；小分子量組采用機(jī)械勻漿、碳酸銨抽提、硫酸銨分級沉淀、丙酮沉淀的工藝路

6、線。 (三)蚯蚓組織脫氧核糖核酸酶(ELMWD)的層析及電泳純化 利用前述方法得到小分子量脫氧核糖核酸酶層析樣品，進(jìn)一步利用DEAE陰離子交換層析、疏水層析的方法分離脫氧核糖核酸酶，以功能膠及瓊脂糖凝膠電泳測活的方法監(jiān)測活性峰的收集。在層析純化的基礎(chǔ)上，采用雙向電泳及雙向功能膠等技術(shù)相結(jié)合的方法，從蚯蚓組織中純化出了一種DNA酶，命名為ELMWD。 二、一種小分子量蚯蚓脫氧核糖核酸酶(ELMWD)的生化表征特征及

7、酶促動力學(xué)研究。 (一)ELMWD酶促反應(yīng)動力學(xué)研究。 利用紫外分光光度法、瓊脂糖凝膠電泳法對ELMWD進(jìn)行最適pH及pH穩(wěn)定性、最適溫度及溫度穩(wěn)定性的研究，研究了不同底物濃度、不同的金屬離子對酶促反應(yīng)速度的影響并給出了各影響因素的參數(shù)。結(jié)果ELMWD最適pH為5.2，在pH4.0-7.0的范圍內(nèi)較穩(wěn)定；最適溫度為37℃，且對溫度比較敏感，在40℃范圍內(nèi)活性相對穩(wěn)定；Mg2+、Ca2+、Mn2+、EDTA對酶的活性有不同

8、程度的抑制作用，5mM的K+對酶的活性有激活作用；當(dāng)以小牛胸腺DNA為底物時酶的Km=0.040μg/μl，Vmax=0.059μg/μl·min-1，當(dāng)以質(zhì)粒DNA為底物時，酶的Km=0.090μg/μl，Vmax=0.11μg/μl·min-1。并且對RNA沒有降解作用。這些參數(shù)與已發(fā)現(xiàn)的各種DNases相比較有明顯差別。 (二)ELMWD生化表征性質(zhì)的研究。 采用SDS-PAGE電泳、生物質(zhì)譜方法對ELMWD的蛋白

9、性質(zhì)包括純度、分子量、肽質(zhì)量指紋圖譜進(jìn)行測定；利用雙向電泳及毛細(xì)管電泳法測定ELMWD的等電點(diǎn)；得出ELMWD的純度在99.5％以上；等電點(diǎn)為4.5；分子量大小為20759.417；肽質(zhì)量指紋圖譜搜索結(jié)果未見有意義的高分匹配蛋白。 三、蚯蚓脫氧核糖核酸酶與固有免疫系統(tǒng)關(guān)系的研究。 本部分圍繞蚯蚓脫氧核糖核酸酶與固有免疫的關(guān)系進(jìn)行了以下幾個方面的研究：研究了脫氧核糖核酸酶的蚯蚓組織分布，為進(jìn)一步理解其功能提供依據(jù)；從與固有

10、免疫相銜接的抵抗外來物質(zhì)(主要是病毒和細(xì)菌)，清除體內(nèi)衰老和畸變細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)兩個角度研究了蚯蚓脫氧核糖核酸酶在蚯蚓固有免疫中的作用和地位。 (一)ELMWD及蚯蚓脫氧核糖核酸酶的組織分布。 采用免疫組化、免疫印跡、單相酶擴(kuò)散、功能膠活性測定法研究了ELMWD及總脫氧核糖核酸酶在蚯蚓組織中的分布。結(jié)果證明ELMWD在赤子愛勝蚓組織內(nèi)的分布是有部位特異性的。免疫組化結(jié)果表明ELMWD主要分布于赤子愛勝蚓的皮膚層及臟層粘膜

11、，構(gòu)成了內(nèi)外兩層屏障，免疫印跡及活性測定結(jié)果表明ELMWD及總脫氧核糖核酸酶在蚯蚓組織分布的順序如下：消化管道，體腔液，體腔壁，體細(xì)胞，循環(huán)系統(tǒng)，生殖系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)。這樣的分布特點(diǎn)與其功能有著密切的聯(lián)系，提示蚯蚓脫氧核糖核酸酶主要參與了蚯蚓的免疫及消化外界微生物的功能。 (二)蚯蚓體腔液活性提取物及ELMWD殺菌活性及機(jī)制的初步探討。 體外殺菌實(shí)驗(yàn)采用細(xì)菌誘導(dǎo)前后蚯蚓體腔液活性提取物對細(xì)菌(G—和G+菌、耐藥菌)結(jié)構(gòu)逐層

12、降解的方法。熒光分光光度法、分光光度法分別檢測對革蘭氏陰性菌外膜，細(xì)胞壁肽聚糖成分和細(xì)胞膜成分的降解作用；瓊脂糖凝膠電泳法檢測對細(xì)菌基因組及質(zhì)粒的降解作用；采用免疫印跡方法檢測細(xì)菌誘導(dǎo)前后ELMWD表達(dá)情況；進(jìn)一步利用生物膜形成實(shí)驗(yàn)檢測了蚯蚓DNaseELMWD抑菌機(jī)制的研究。結(jié)果證明ELMWD細(xì)菌誘導(dǎo)后表達(dá)增高；蚯蚓體腔液活性提取物能夠由外向內(nèi)逐層降解細(xì)菌的結(jié)構(gòu)而起到殺滅細(xì)菌的作用；ELMWD獨(dú)立沒有殺菌作用，但是能夠協(xié)同其他免疫分子

13、的殺菌活性，并且能夠協(xié)同溶菌酶降解細(xì)菌的基因組；可以抑制細(xì)菌生物膜的形成。 (三)蚯蚓體腔液活性提取物及ELMWD抗腫瘤活性及機(jī)制的初步探討。 本章內(nèi)容利用MTT和SRB方法檢測了蚯蚓體腔液活性提取物及ELMWD抑制四種腫瘤細(xì)胞增殖的活性；采用Hochest熒光染色和單細(xì)胞凝膠電泳檢測腫瘤細(xì)胞基因組的情況；采用TranswellMigration實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，并且還利用動物實(shí)驗(yàn)檢測ELMWD抗腫瘤結(jié)果。結(jié)果證明

14、蚯蚓體腔液活性提取物有顯著的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性；腫瘤細(xì)胞基因組被降解為小的碎片。流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測到凋亡細(xì)胞存在，認(rèn)為對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用主要通過將細(xì)胞阻滯在S期以及通過細(xì)胞凋亡所致。而ELMWD體外對抑制腫瘤細(xì)胞的增殖作用不顯著，但是體內(nèi)可以顯著抑制腫瘤的生長作用。體外還可以顯著協(xié)同活性提取物的抗腫瘤作用，而且對腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移具有明顯的抑制作用。 (四)蚯蚓體腔液粗提物及ELMWD殺抗病毒活性及機(jī)制的初步探討。

15、 本章內(nèi)容利用病毒噬斑實(shí)驗(yàn)及陰陽離子交換層析的方法從蚯蚓組織分離出三組具有非特異性抗病毒(流感病毒、腺病毒、輪狀病毒)活性的成分，這三組成分分別具有高活性的蛋白酶、溶菌酶和核酸酶(DNase和RNase)。三組成分混合以后抗病毒能力并不能恢復(fù)到蚯蚓體腔液活性提取物的水平，但是要高于每個活性組。本研究同時測定了蚯蚓DNaseELMWD的抗病毒能力，證明ELMWD抗腫瘤活性不明顯，但是可以顯著協(xié)同活性提取物的抗病毒能力。其中核酸酶成分組及E

16、LMWD具有降解病毒遺傳物質(zhì)的能力。 結(jié)論： 1．在前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，擴(kuò)充了一種酶活性測定方法，提出并驗(yàn)證了一種分辨率高的、能夠監(jiān)測酶種類變化的兼有測活作用的SDS-PAGE-dNA功能膠方法，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)奠定了方法基礎(chǔ)。 2．優(yōu)化并建立了蚯蚓組織中兩組遷移率不同的脫氧核糖核酸酶層析樣品的制備工藝。 3．建立了一套成熟的小分子量的蚯蚓脫氧核糖核酸酶(ELMWD)的純化工藝。 4．獲得了一種新型的純

17、度較高的脫氧核糖核酸酶(ELMWD)，分子量為20759Da，等電點(diǎn)4.5，最適pH為5.2，最適溫度為40℃，對線狀小牛胸腺DNA比對環(huán)狀質(zhì)粒DNA的親和力高，對RNA沒有降解作用。酶學(xué)性質(zhì)及質(zhì)譜鑒定結(jié)果提示這種酶是一種不同于其他的已發(fā)現(xiàn)的DNase的脫氧核糖核酸酶。 5．蚯蚓脫氧核糖核酸酶屬于蚯蚓固有免疫的一個很重要的元素，脫氧核糖核酸酶與其他免疫分子協(xié)同或獨(dú)立的在降解內(nèi)外源廢棄細(xì)胞及微生物的遺傳物質(zhì)上發(fā)揮了不可替代的作用。