酯酶的克隆、表達(dá)、篩選以及立體選擇性的定向進(jìn)化研究.pdf

1、酯酶(EC3.1.1.x)是能夠催化一系列酯鍵生成相應(yīng)的酸和醇的重要生物催化劑。其在有機(jī)溶劑中有較好的穩(wěn)定性、活性及立體選擇性，因此被廣泛用于合成食品添加劑、農(nóng)用化學(xué)品和醫(yī)藥中間體等重要化合物.在本課題中，我們采用分子克隆手段，從大腸桿菌K-12中克隆表達(dá)出一系列的酯酶并且研究其性質(zhì)。另外我們通過(guò)定向進(jìn)化對(duì)該類(lèi)酶進(jìn)行改造，獲得了立體選擇性得到明顯提高的酯酶。
　　 通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)分析，從大腸桿菌K-12中篩選了酯酶基因

2、，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，獲得了31個(gè)不同的酯酶基因片段，用內(nèi)切酶雙酶切后，與經(jīng)過(guò)相同的限制性?xún)?nèi)切酶切割的載體pET-30a(+)連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中。重組菌在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析后，獲得了相應(yīng)的目標(biāo)蛋白。
　　 建立了一種結(jié)合酯酶活性與立體選擇性的高效篩選策略。以4-硝基苯丁酸酯為活性篩選的底物，通過(guò)檢測(cè)405nm下的吸光度，獲得了5個(gè)活性較好的酯酶(XL3，XL10，XL15，XL27，XL31)

3、。再以1-乙酸苯乙酯作為底物進(jìn)行立體選擇性篩選，以1mmol/L溴百里香芬蘭作為指示劑，利用酶標(biāo)儀在630nm下檢測(cè)各個(gè)酶催化水解反應(yīng)中吸光度的變化，獲得了對(duì)1-乙酸苯乙酯具有較高立體選擇性的酯酶XL15。利用1-乙酸苯乙酯的水解反應(yīng)和酯化反應(yīng)對(duì)XL15進(jìn)行復(fù)篩，轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到31.2％和36.8%，其對(duì)映體選擇性(E值)均大于100。
　　 在對(duì)克隆獲得酯酶的酶學(xué)性質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)于短鏈4-硝基苯酯，上述5個(gè)酯酶均具有較高的

4、活性，但對(duì)于長(zhǎng)鏈4-硝基苯酯，酶的活性明顯下降。不同的酶的最佳反應(yīng)pH值和反應(yīng)溫度亦不同。
　　 通過(guò)對(duì)酯酶XL15進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，獲得了最佳蛋白表達(dá)條件：IPTG濃度為0.1mmol/L，誘導(dǎo)前菌體生長(zhǎng)量為OD600=0.7，誘導(dǎo)溫度為30℃。進(jìn)一步對(duì)酯酶XL15進(jìn)行蛋白純化，獲得了大小為28kDa的目標(biāo)條帶。通過(guò)序列分析與比對(duì)，XL15屬于α/β/α水解酶結(jié)構(gòu)，具有典型的Ser-His-Asp活性位點(diǎn)。初步預(yù)測(cè)表明，

5、其活性中心附近存在一個(gè)類(lèi)似“口袋”的結(jié)構(gòu)，對(duì)于R-乙酸苯乙酯，手性碳上苯環(huán)的指向使得甲基能夠比較好地契合到小口袋中，從而使該酶具有對(duì)R-乙酸苯乙酯較好的立體選擇性。
　　 為了提高酯酶的立體選擇性，我們采用了定向進(jìn)化手段.所研究的酶為來(lái)自紅球菌Rhodobacter sphaeroides的RSP_2728酯酶。整個(gè)過(guò)程中，我們建立了有效的定向進(jìn)化策略和高通量篩選方法。利用易錯(cuò)PCR技術(shù)，進(jìn)行了四輪突變，獲得了突變株A6A5，B

6、7F11，C8G1和D3E11，在對(duì)扁桃酸甲酯的水解反應(yīng)中，其立體選擇性相比較于野生菌株，對(duì)映體選擇率（E值）從3.1分別提高到5.3，8.8，14.0和30.8;活性相對(duì)于野生菌株，從10U/mg分別提高到43U/mg，142U/mg，88U/mg和24U/mg。序列分析表明，突變體A6A5的62位上的氨基酸發(fā)生了突變，由原先的天冬酰胺變成了酪氨酸；突變體B7F11的62位上的氨基酸由天冬酰胺變?yōu)榱死野彼幔?45位上的亮氨酸變成了組氨