Diallyl Disulfide對化學誘導皮膚癌的預防作用及其作用機制研究.pdf

1、背景與目的：
　　癌癥患者數(shù)量與日俱增，通過手術切除、放化療、甚至分子靶向抑制劑等單純的治療都無法完全根治癌癥，且醫(yī)療花費巨大。癌癥等重大疾病的的預防一直是研究的重點。選擇低毒、經(jīng)濟且可長期應用的天然化合物預防癌癥的策略正逐步受到人們的重視。黑蒜是一種新型的大蒜加工食品，具有抗菌、抗腫瘤、抗炎等許多生物學活性。黑蒜中的Diallyl Disulfide(DADS)具有抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡及抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的潛能。本研

2、究在于考察DADS對于化學致癌物誘導的小鼠皮膚癌體內(nèi)和體外模型的預防作用，并闡明其確切的作用機制。
　　內(nèi)容與結(jié)果：
　　本研究首先利用經(jīng)典的DMBA/TPA兩階段致癌模型及TPA誘導的JB6 P+細胞克隆形成實驗分別在體內(nèi)外考察DADS的癌癥預防作用。結(jié)果表明預先給予DADS在體內(nèi)可以濃度依賴性地降低皮膚乳突狀淋瘤的發(fā)生率、平均荷瘤數(shù)目、腫瘤的大小以及在體外同樣可以濃度依賴性地減少TPA誘導的克隆形成數(shù)目。考慮到DADS具

3、有較強的抗氧化活性，通過檢測小鼠背部皮膚中活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)的水平，發(fā)現(xiàn)預先給予DADS可以清除TPA誘導的高水平ROS含量，這主要與抗氧化酶活力的升高有關。采用Real-time PCR檢測，發(fā)現(xiàn)DADS在體內(nèi)外模型中均可以濃度依賴性地提升抗氧化酶的mRNA水平。進一步通過免疫組化和WesternBlot研究發(fā)現(xiàn)DADS可以在體內(nèi)外濃度依賴性地促進小鼠皮膚細胞中的Nrf2入核。以上結(jié)果初

4、步表明DADS的癌癥預防作用與誘導Nrf2入核相關。選用Nrf2-/-小鼠進行反向驗證，結(jié)果表明DADS無法預防DMBA/TPA誘導的Nrf2-/-小鼠背部皮膚乳突狀淋瘤的發(fā)生與生長以及無法減少DMBA/TPA誘導的小鼠背部皮膚增厚。由此證明了DADS是通過誘導Nrf2入核促進抗氧化酶表達增多發(fā)揮癌癥預防作用。利用細胞在體外探究DADS促進Nrf2入核的具體機制，通過WesterBlot和免疫熒光實驗初步發(fā)現(xiàn)DADS可以時間依賴性地上調(diào)

5、Nrf2的核表達。其中，DADS作用4-8h時能顯著增加Nrf2的核內(nèi)表達。另外，通過給予p-Akt抑制劑MK2206反向驗證，進一步排除了DADS是通過激活MAPKs和Akt信號通路后引起Nrf2入核的級聯(lián)反應。進一步研究發(fā)現(xiàn)，DADS能夠時間依賴地誘導Nrf2總蛋白表達水平升高，但不影響Nrf2的mRNA水平。選用蛋白酶抑制劑MG132與DADS合用，結(jié)果表明DADS與MG132協(xié)同抑制Nrf2降解。由此可知DADS是通過抑制Nrf

6、2的降解，從而引起了Nrf2的胞內(nèi)蓄積及后續(xù)的入核。為了探究DADS抑制Nrf2降解的機制，我們首先排除了DADS對Nrf2胞內(nèi)抑制因子Keap1的影響。而DADS能夠時間依賴地增加Nrf2的另一個結(jié)合蛋白p21的表達水平。而p21可以與Keap1競爭性結(jié)合Nrf2，減少其降解。通過免疫共沉淀檢測發(fā)現(xiàn)DADS不僅能促進p21的表達，而且能夠促進p21與Nrf2的結(jié)合，進而減少了Nrf2的降解。此外，我們選用HEK293T細胞轉(zhuǎn)染p21

7、siRNA反向驗證了p21在DADS調(diào)節(jié)Nrf2蛋白水平過程中的重要作用。
　　結(jié)論與意義：
　　基于以上結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)DADS成分可以預防化學致癌物誘導的小鼠背部皮膚乳突狀淋瘤的發(fā)生和生長。給予DADS能夠促進p21與Nrf2結(jié)合增多，進而減少了Nrf2的降解，增加了Nrf2的核表達并啟動下游轉(zhuǎn)錄，促進抗氧化酶的表達上調(diào)，從而減少了ROS對機體的損傷，最終發(fā)揮了癌癥預防作用。該課題闡明了DADS具有很好的癌癥預防潛能并明確