AMPK激活劑metformin和AICAR抑制紫外線輻射誘導皮膚癌的機制研究.pdf

1、前言：
　　 日光紫外線(ultra violetradiation,UV)照射可引起急性損傷如日曬傷和慢性累積性損傷如皮膚癌及光老化。日光中紫外線誘導的DNA損傷是導致皮膚癌發(fā)生的一個重要因素,同時在皮膚癌細胞中發(fā)現(xiàn),調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡的特異性基因出現(xiàn)與紫外線損傷相關的變異。根據(jù)日光中紫外線波長的不同,可將其分為3種:UVA,UVB和UVC,造成生物損害的紫外線主要是波長短,能量較高的UVB(波長290-320nm),是

2、導致DNA損傷的主要類型。目前已證實一些原癌基因和抑癌基因由于紫外線引起的DNA損傷而發(fā)生變異。UV誘導產(chǎn)生皮膚癌是一個復雜的過程,涉及到許多細胞和分子水平上的變化,同時還與DNA的修復作用相關。
　　 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及遠處轉移是一個復雜的過程,事實上,惡性增生多數(shù)是由多種因素和多條信號轉導通路失調(diào)促成的。磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)是體內(nèi)的能量調(diào)節(jié)器,AMPK激活后可促進葡萄糖重吸收、糖酵解和脂肪酸氧化,減少脂肪酸、膽固

3、醇和蛋白質(zhì)的合成,儲存能量,被稱為“細胞能量調(diào)節(jié)器”,近年來關于該通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用研究很多,發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤中表達缺失。AICAR和metformin是目前研究最多的AMPK通路激活劑,本文通過體外細胞實驗及構建SKH-1無毛小鼠紫外線致皮膚癌模型研究該藥物對紫外線輻射誘導皮膚癌的預防和治療作用,并闡明其機制。
　　 目的：
　　 本實驗擬觀察AICAR和metformin處理的正常人上皮角化細胞(norma

4、lhumanepidermalkeratinocytes,NHEK)及AMPKwide-type(WT)和AMPKknockdown(KD)鼠胚胎成纖維細胞(mouseembryonicfibroblast,MEF),經(jīng)過紫外線(主要是UVB)輻射后AMPK通路相關分子改變,及DNA損傷修復改變,并通過構建紫外線致SKH-1無毛小鼠皮膚癌模型研究這兩種藥物對紫外線輻射誘導皮膚癌的預防和治療作用,并探討其作用機制。
　　 材料與方

5、法：
　　 1、常規(guī)培養(yǎng)的MEF細胞WT和KO,加或不加AICAR及metformin處理24,48,72h后,MTS方法檢測細胞存活曲線。
　　 2、常規(guī)培養(yǎng)的MEF細胞,WT和KD,照射UVB(10焦耳),后0,6,24,48h提取DNA;常規(guī)培養(yǎng)的MEF細胞WT和KD分別加或不加AICAR及metformin培養(yǎng)24h后,照射UVB(10焦耳),后0,6,24h提取DNA;SKH-1無毛小鼠,UVB照射前1h,后背

6、涂或不涂丙酮配置的AICAR和metformin溶液,進行單次UVB照射后處死小鼠,剝離皮膚提取DNA;SlotBlot方法檢測UVB照射后不同時間DNA片段CPD及6-4PP修復情況。
　　 3、動物實驗:動物培養(yǎng)遵守芝加哥大學動物保護和使用機構條例,分為2部分,第一部分,預防輻射致皮膚癌模型:SKH-1無毛小鼠,分為4組,對照組,單純照射組,AICAR(1umol)處理組,Metformin(2umol)處理組,每周UVB照

7、射(100mJ/cm2)三次,連續(xù)25周,實驗組小鼠每次照射前后背照射區(qū)域皮膚涂AICAR或metformin。每周記錄小鼠體重變化及皮膚變化,記錄腫瘤發(fā)生時間,及腫瘤數(shù)目。第二部分,輻射致皮膚癌治療模型:SKH-1無毛小鼠,每周UVB照射(100mJ/cm2)三次,至17周,按照生成腫瘤大小及數(shù)目隨機分為單純照射組,metformin涂藥治療組,metformin灌胃治療組,繼續(xù)照射,每日照射前進行相應處理。繼續(xù)每周記錄腫瘤數(shù)目,大小

8、變化。
　　 4、提取細胞蛋白,小鼠后背皮膚蛋白,采用Westernblot法檢測ERK通路相關分子變化及DNA修復相關蛋白變化。
　　 5、HE染色觀察照射后各組小鼠皮膚上皮增生增厚情況。
　　 6、免疫組化方法檢測照射后小鼠正常皮膚及腫瘤組織增殖因子Ki67表達情況。
　　 7、采用Prism5(GraphPadsoftware,SanDiego,CA)統(tǒng)計軟件分析,所有數(shù)據(jù)用3次獨立實驗的均值±標準

9、誤表示,采用t檢驗及方差分析,P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1、為了證實AMPK信號通路在皮膚癌發(fā)生發(fā)展中的作用,我們用WesternBlot檢測了P-AMPK,P-ACC,ACC在正常人皮膚上皮細胞,人皮膚癌細胞,紫外線誘導小鼠皮膚癌細胞,及紫外線照射后0.5,6,24h正常小鼠皮膚、未照射小鼠皮膚中的表達,我們發(fā)現(xiàn)AMPK信號通路在皮膚腫瘤中被抑制,紫外線照射短時間內(nèi)0.5和6h時被激活,24h后

10、被抑制。
　　 2、激活AMPK通路抑制紫外線誘導的小鼠皮膚腫瘤形成。我們用AMPK信號通路激活劑AICAR及metformin處理SKH-1無毛小鼠,westernBlot結果顯示P-ACC表達增加,AICAR和metformin激活小鼠皮膚AMPK通路;應用AICAR及metformin的紫外線照射組與單純紫外線照射相比,用藥組延遲紫外線誘導小鼠皮膚癌發(fā)生時間,減少腫瘤生成個數(shù)及大小。
　　 3、AICAR和metf

11、ormin通過AMPK通路增加UVB導致的DNA損傷后修復。在WT和KO的MEF細胞經(jīng)過UVB照射后的slotblot結果顯示,AMPK缺失的MEF細胞顯著減少了CPD片段修復,但是對6-4PP修復無明顯影響(P＜0.05,Student'st-testandtwo-wayANOVA);在AICAR和metrormin預處理的小鼠皮膚,紫外線照射后,6小時CPD修復增加,但是24小時的CPD及6-4PP修復未見改變。AICAR和metf

12、ormin處理的MEF細胞,紫外線照射后,AMPK-WT細胞CPD修復效率提高,但對AMPK-KO細胞無影響。另外,分子水平通過WesternBlot檢測,我們發(fā)現(xiàn)AMPK缺失的MEF細胞,XPC表達明顯減少,同時,AICAR和metformin增加NHEK細胞的XPC表達。
　　 4、AICAR和metformin抑制細胞增殖不依賴于AMPK通路。我們觀察HE染色的對照組小鼠,AICAR和metformin處理的不同組小鼠上皮

13、增生情況,發(fā)現(xiàn)慢性紫外線照射使小鼠皮膚上皮層厚度增加約10倍,而AICAR和metformin處理組小鼠的上皮增生程度明顯減少;免疫組化檢測增殖因子Ki67,我們發(fā)現(xiàn)AICAR和metformin處理組小鼠皮膚上皮層Ki67陽性細胞較對照組明顯減少(P＜0.05,Student'st-test)。這些數(shù)據(jù)表明AICAR和metformin抑制細胞增殖。為了驗證AMPK信號通路與該抑制作用的關系,我們研究AICAR和metformin作用

14、于AMPK-WT和KO的MEF細胞,發(fā)現(xiàn)AMPK缺失的MEF細胞在48、72h顯著增加細胞增殖,AICAR和metformin對WT和KO的MEF細胞都有抑制作用,提示我們AMPK通路對于控制細胞增殖有重要作用,但是AICAR和metformin的抑制增殖作用不依賴于AMPK通路。
　　 5、我們通過研究mTOR和ERK通路探索AICAR和metformin抑制細胞增殖的機制。WesternBlot結果發(fā)現(xiàn),在AICAR和met

15、formin處理后的小鼠皮膚,ERK表達明顯降低,但是mTOR通路下游4EBP1表達無明顯改變;AMPK缺失的MEF細胞,ERK和其上游EGFR表達均明顯增高,4EBP1表達仍無明顯差異,在AMPK-KO細胞,抑制EGFR表達,減少ERK磷酸化和CyclinD1水平,抑制ERK也降低CVclinD1水平。同樣AICAR和metformin降低NHEK細胞的ERK活性。這些數(shù)據(jù)顯示AMPK是EGFR/ERK/CyclinD1通路抑制劑。然

16、而,AICAR和metformin不但降低AMPK-WT細胞ERK活性,同時降低AMPK-KO細胞ERK活性,說明其對ERK通路抑制不是通過AMPK通路,相反,AICAR和metformin對WT和KO細胞的EGFR磷酸化均沒有影響,提示我們AICAR和metformin的作用為EGFR下游ERK上游之間的一個靶點。
　　 6、在慢性UVB誘導的小鼠皮膚癌模型,至17周時,每只小鼠約發(fā)生3-4個腫瘤,直徑平均約2-4mm,隨機分

17、為空白對照組,metformin外涂(Met-T),metformin口服灌胃(Met-G),結果顯示應用metformin的兩組小鼠均減少了新腫瘤形成,且和對照組相比明顯抑制已形成腫瘤的生長,口服灌胃組治療效果更明顯(P＜0.05.Smdent'st-test)。WesternBlot結果顯示在Met-T和Met-G組小鼠照射區(qū)正常皮膚均增加ACC磷酸化,激活AMPK通路;HE染色發(fā)現(xiàn)Met-T和Met-G組小鼠照射區(qū)非腫瘤部分皮膚增

18、生較對照組明顯減少;免疫組化結果顯示Met-T和Met-G組增殖因子Ki67陽性細胞較對照組明顯減少。
　　 討論：
　　 近年來關于磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)-細胞能量調(diào)節(jié)器的研究很多,研究表明激活AMPK信號通路對腫瘤生長和存活有抑制作用,該通路激活劑AICAR及經(jīng)典降糖藥物metformin可以通過激活AMPK增強其抗腫瘤作用。但是AICAR和metformin是否能調(diào)節(jié)正常細胞基因組的完整性及其作用機制未見

19、研究,本實驗研究結果表明,AMPK通路在人皮膚腫瘤及紫外線(UVB)誘導小鼠皮膚腫瘤中表達降低。動物實驗結果表明,表皮涂抹AMPK激活劑AICAR或metformin可以減少紫外線誘導小鼠皮膚腫瘤形成,在紫外線誘導小鼠腫瘤模型中,表皮涂抹或者口服metformin可以減少新的腫瘤形成并且抑制已形成腫瘤的生長。機制研究表明,AICAR和metformin可以通過AMPK信號通路促進紫外線導致的DNA損傷修復,然而他們卻未依賴于AMPK通路

20、抑制細胞增殖。我們本實驗結果顯示AICAR和metformin可以通過促進正常皮膚細胞在受到紫外線照射損傷后的DNA修復,降低因DNA損傷變異發(fā)生腫瘤的幾率。
　　 首先,我們的研究結果顯示了能量代謝和基因組穩(wěn)定性的關系,在紫外線誘導的DNA損傷修復中需要AMPK參與。我們通過以下幾個方面的證據(jù)來驗證該結論:(1)AICAR和metformin促進紫外線誘導的小鼠皮膚DNA損傷修復。(2)AMPK缺失的MEF細胞DNA損傷修復被

21、抑制。(3)在AMPK缺失的MEF細胞,AICAR和metformin促進DNA損傷修復作用消失。分子水平機制研究中我們發(fā)現(xiàn),核苷酸切除修復(GG-NER)的關鍵蛋白XPC,在AMPK缺失的MEF表達中明顯降低,而AICAR和metformin能夠增加該蛋白的表達,但是關于AMPK如何調(diào)控XPC的機制需要進一步研究。已有研究證實環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CyclobutanePyrimidineDimer,CPD)是紫外線對DNA損傷導致皮膚癌

22、的首要環(huán)節(jié),而我們的研究顯示,AMPK通路激活對增強核苷酸外切修復(GG-NER)能力具有重要意義,通過GG-NER修復CPD,從而減少皮膚癌發(fā)生。
　　 另一方面,我們的研究結果顯示AICAR和metformin抑制小鼠皮膚上皮細胞增殖,減少紫外線導致的上皮增生。AMPK通過抑制有絲分裂EGFR/ERK通路抑制細胞增殖,相反,AICAR和metformin均抑制ERK通路但是對EGFR表達無明顯影響。AICAR和metform

23、in抑制細胞增殖及對ERK通路的抑制不依賴于AMPK通路,因為我們的研究結果發(fā)現(xiàn)在AMPK缺失的MEF細胞,AICAR和metformin的細胞生存抑制作用及ERK通路的抑制作用仍然存在。但是有趣的是,前人的關于AICAR/AMPK和ERK通路的研究結果與我們的研究結果正好相反。在胚胎成纖維細胞(NIH-3T3)和心肌纖維細胞,AICAR抑制生長因子誘導的ERK通路激活,這個作用是通過AMPK通路但是與EGFR表達無關;相反在白血病K5

24、62細胞,ERK激活需要AMPK,所以我們總結AICAR調(diào)節(jié)ERK通路的作用是細胞特異性的,與細胞系有關。我們的研究結果顯示,在皮膚細胞及小鼠成纖維細胞(MEF),AICAR和metformin抑制ERK通路既不依賴于AMPK通路也不依賴于EGFR通路。另外,雖然已有研究結果表明AMPK和metformin抑制mTOR通路,但是我們的研究結果發(fā)現(xiàn),在小鼠皮膚細胞和小鼠成纖維細胞系MEF,AICAR和metformin并沒有影響mTOR信

25、號通路活動。實際上,一個關于膠質(zhì)母細胞瘤的研究結果顯示,盡管AICAR沒有像mTOR信號通路抑制劑雷帕霉素那樣明顯抑制mTOR信號通路,但是它對該細胞的生長抑制作用卻比雷帕霉素強,這一結果無疑是對mTOR信號通路抑制作用的一個挑戰(zhàn)。下一步,我們將繼續(xù)研究AICAR和metformin對ERK通路抑制及控制增殖的分子機制,進一步闡明mTOR在AICAR和metformin治療腫瘤作用中的作用機制。
　　 總之,我們的實驗結果表明,

26、AMPK激活劑AICAR和metformin可以抑制紫外線誘導的皮膚腫瘤,他們通過激活AMPK通路促進紫外線誘導的DNA損傷修復,但是他們通過抑制ERK通路抑制細胞增殖作用是非AMPK通路依賴的。我們的研究結果顯示,AICAR和廣泛應用的抗代謝藥物metformin對紫外線輻射誘導皮膚腫瘤具有潛在的化學預防作用,尤其是對于有皮膚癌病史的患者更有價值。
　　 結論：
　　 1、AMPK信號通路在人皮膚鱗癌細胞和慢性紫外線照

27、射誘導的小鼠皮膚腫瘤中被抑制。
　　 2、激活AMPK信號通路抑制紫外線誘導的SKH-1無毛小鼠腫瘤生成。
　　 3、AICAR和metformin通過激活AMPK信號通路增加紫外線誘導的DNA損傷修復。
　　 4、AICAR和metformin抑制細胞增殖是AMPK信號通路非依賴性的。
　　 5、AICAR和metformin抑制MEF細胞及皮膚腫瘤中ERK信號通路。
　　 6、在慢性紫外線照射