AICAR誘導激活的AMPK在肝臟抑制TSH-SREBP-2-HMGCR通路.pdf

1、目的:
　　研究AMPK在肝臟中是否可通過SREBP-2在調節(jié)肝臟膽固醇代謝中起到積極作用，以及是否AMPK對TSH介導的SREBP-2的上調具有影響，這也許可為將來臨床治療與TSH相關的高膽固醇血癥提供依據。
　　方法:
　　1.體外實驗:在HepG2細胞中，用AMPK激動劑AICAR、TSH分別處理細胞，用SAMS試驗檢測AMPK活性變化，觀察SREBP-2胞漿前體及核內活性形式及其靶基因HMGCR、HMGCS的表

2、達變化。
　　2.體內試驗:采用野生型(Tshr+/+)和TSH受體敲除（Tshr-/-）小鼠，AMPK激動劑AICAR腹腔注射Tshr+/+和Tshr-/-小鼠，觀察胞漿及核內成熟體SREBP-2及其靶基因HMGCR、HMGCS的表達變化。
　　3.用AMPK激動劑AICAR處理HepG2細胞，2×Flag-SREBP-2質粒瞬時轉染表達SREBP-2核內活性形式，免疫沉淀SREBP-2、免疫印跡絲氨酸或蘇氨酸磷酸化抗體驗

3、證AMPK可磷酸化SREBP-2核內活性形式。
　　4.在AMPK激動劑AICAR處理HepG2、L02細胞、Tshr-/-、Tshr+/+小鼠，肝細胞總蛋白免疫沉淀SREBP-2、免疫印跡絲氨酸或蘇氨酸磷酸化抗體驗證AMPK可磷酸化SREBP-2胞漿前體形式。
　　5.雙重免疫熒光染色法驗證TSH對AMPK磷酸化SREBP-2的抑制作用。
　　6.主要技術:Real-Time PCR、免疫沉淀、免疫印跡、免疫熒光、質

4、粒瞬時轉染及建立小鼠試驗模型等。
　　結果:
　　1.TSH在HepG2細胞上調SREBP-2蛋白水平和HMGCR、HMGCS的表達。
　　SREBP-2在肝臟優(yōu)先調節(jié)負責膽固醇合成與吸收的靶基因如HMGCR、HMGCS，在給予TSH(4μM)處理HepG2細胞，SREBP-2前體及核內活性形式被發(fā)現(xiàn)呈時間依賴方式增加。TSH處理后HMGCR的mRNA在24小時和48小時均上調，HMGCS的mRNA在48小時上調(p＜

5、0.05）。
　　2.HepG2細胞AICAR激活AMPK可直接抑制SREBP-2的表達。
　　SREBP-2可在多個水平被調控如固醇反饋機制或轉錄水平、翻譯后修飾等多個方面，曾有證據表明SREBP-2是AMPK的一個直接靶點，AMPK可直接抑制SREBP-2的轉錄活性。為了探討AMPK激活后是否對SREBP-2的前體和核內形式具有調節(jié)作用，HepG2細胞給予AMPK的激動劑AICAR處理12小時和24小時，作為AMPK激活

6、的標志，磷酸化AMPK和磷酸化ACC水平明顯增加并且呈時間依賴性，SREBP-2前體在AICAR孵育12小時有一個輕度減少，而在處理24小時跟隨著出現(xiàn)一個明顯減少，但是SREBP-2的核內形式在整個處理期間呈現(xiàn)一個明顯連續(xù)減少。
　　為證實這種變化，我們用實時PCR監(jiān)測SREBP-2的mRNA水平，AICAR誘導激活的AMPK以時間依賴方式減少了SREBP-2的mRNA水平。在AICAR處理HepG2細胞，核內SREBP-2的免疫

7、熒光強度明顯降低。
　　3.AICAR處理的Tshr+/+ and Tshr-/-小鼠肝臟中，AMPK激活可減少SREBP-2蛋白及其靶基因表達。
　　早先曾有報道在甲狀腺及肝臟中TSH能夠抑制AMPK活性。為了進一步研究TSH和AMPK對SREBP-2的影響，我們建立Tshr+/+ and Tshr-/-小鼠模型，與Tshr+/+小鼠相比，Tshr-/-小鼠肝臟中SREBP-2前體及核內形式均減少了，盡管確切機制尚不清楚。

8、HMGCR的mRNA水平也明顯減少，HMGCS的mRNA呈現(xiàn)一個減少趨勢。
　　在PBS處理的Tshr-/-小鼠相較于Tshr+/+小鼠，小鼠肝臟中AMPK活性增加，而且，Tshr-/-小鼠肝臟中SREBP-2的前體及核內蛋白均明顯減少。在AICAR處理的Ts hr-/-和Tshr+/+小鼠的肝臟，AMPK活性增強，SREBP-2蛋白水平降低。AICAR導致一個HMGCR mRNA明顯降低。
　　4.HepG2細胞AICAR

9、激活AMPK可抑制TSH誘導的SREBP-2的上調。
　　為了進一步驗證TSH對AMPK活性的影響，在體外我們采用SAMS多肽磷酸化試驗，HepG2細胞給予TSH處理后，AMPK活性明顯降低，而AICAR處理HepG2細胞后，AMPK活性明顯增強。下一步我們研究TSH誘導的SREBP-2上調是否通過AMPK激活，我們發(fā)現(xiàn)TSH誘導上調的SREBP-2的前體及核內形式可被AICAR減輕。
　　為了明確AMPK激活抑制SREBP

10、-2后的功能結果，用實時PCR評價SREBP-2的靶蛋白酶的轉錄水平變化，同動態(tài)變化的SREBP-2蛋白一致，在HepG2細胞中TSH刺激升高的HMGCR和HMGCS的mRNA水平被AICAR減弱。
　　5.在AICAR誘導AMPK激活的細胞及小鼠肝臟中，SREBP-2的蘇氨酸位點可被磷酸化。
　　AMPK作為一個進化的保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在調節(jié)關鍵代謝過程中具有重要作用，可磷酸化多種涉及脂肪酸氧化、膽固醇合成過程中間

11、酶激活或者抑制這些酶的活性。近來研究證實在HEK293細胞和LDLR敲除小鼠肝臟中，SREBP-2是AMPK的直接靶點。為了研究AMPK是否涉及到SREBP-2的磷酸化修飾，我們利用特異性蘇氨酸磷酸化抗體和絲氨酸磷酸化抗體，首先SREBP-2抗體免疫沉淀總蛋白，使用蘇氨酸磷酸化抗體和絲氨酸磷酸化抗體進行免疫印跡分析，顯示SREBP-2的前體和核內形式均有蘇氨酸位點磷酸化，SREBP-2無絲氨酸位點磷酸化。我們已經顯示在Tshr-/-小鼠

12、較Tshr+/+小鼠AMPK活性增強，同前述的結果一致，在Tshr-/-小鼠中內源性SREBP-2前體蘇氨酸磷酸化的水平增加。在人肝L02細胞中也得到相似結果。
　　6.AMPK磷酸化SREBP-2，而TSH可抑制AMPK對SREBP-2的磷酸化。
　　結論:
　　1.AMPK在肝臟可抑制TSH介導的對SREBP-2及其靶基因HMGCR、HMGCS的上調作用。
　　2.AMPK可直接磷酸化SREBP-2前體及核內