1、CRTC2通過FoxO1-SREBP-2-HMGCR調(diào)節(jié)肝臟膽固醇的合成的研究2、TSH通過上調(diào)肝臟中CRTC2的表達(dá)促進(jìn)肝臟糖異生的研究.pdf

1、論文一 CRTC2通過FoxO1/SREBP-2/HMGCR調(diào)節(jié)肝臟膽固醇的合成
　　研究背景:
　　糖代謝紊亂和脂代謝紊亂往往共同存在，并且相互影響。高脂血癥的患者可引起影響血糖的多個臟器功能的紊亂。血脂過高引起肝臟功能異常，導(dǎo)致肝臟糖異生及糖原合成和分解過程的紊亂;高膽固醇血癥可加劇胰島beta細(xì)胞的損傷，進(jìn)一步加重糖尿病患者的病情。同時，血糖水平的異常也會加重脂代謝的紊亂。血糖高于正常值的患者及2型糖尿病患者存在膽固醇

2、轉(zhuǎn)化及合成過程的異常。而糖尿病患者血糖的控制情況同樣影響其血脂的控制，并且糖尿病患者糖化血紅蛋白水平與血脂水平呈正相關(guān)。
　　CRTC2是重要的調(diào)節(jié)糖代謝的因子，在空腹時可通過促進(jìn)肝臟的糖異生水平增加血糖;而進(jìn)食后可降低肝臟糖異生的效率，減少血糖，從而維持正常的血糖水平。但是近年的文獻(xiàn)報道，在CRTC2敲除的小鼠中存在血甘油三酯水平的下降。并且在3T3L1細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)shRNA CRTC2后，細(xì)胞中甘油三酯的水平也明顯降低。這些

3、數(shù)據(jù)提示我們CRTC2是否除了調(diào)節(jié)糖代謝外還參與了脂代謝的調(diào)控？
　　FoxOs是轉(zhuǎn)錄因子forkhead家族的一員，主要通過特異性的識別基因啟動子區(qū)上IRE（insulin response element，IRE）序列調(diào)節(jié)下游目的基因的表達(dá)。在哺乳動物體內(nèi)，F(xiàn)oxOs家族有四個主要成員:FoxO1，F(xiàn)oxO3， FoxO4和FoxO6，他們作為重要的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)了多種細(xì)胞信號通路:如能量代謝通路，應(yīng)激及壽命。FoxOs在CRT

4、C2存在時主要以磷酸化的形式存在于細(xì)胞漿中。當(dāng)受到刺激后可脫磷酸化被激活并且進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)激活目的基因。另外，F(xiàn)oxOs的乙?；揎椧部梢哉{(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性。作為FoxOs家族的一員，F(xiàn)oxO1主要調(diào)節(jié)肝臟的糖異生水平。FoxO1可以通過識別糖異生的關(guān)鍵酶PEPCK和G6P啟動子區(qū)IRE序列，調(diào)節(jié)肝臟糖異生的能力。近年研究發(fā)現(xiàn):FoxO1不僅能調(diào)節(jié)糖代謝的相關(guān)基因，還可以調(diào)節(jié)脂代謝的相關(guān)因子。小鼠肝臟長期敲除FoxO1后，肝臟糖生成水平明顯

5、下降的同時，血液中膽固醇、游離脂肪酸及VLDL的表達(dá)明顯增加。此外，F(xiàn)oxO1可特異性識別SREBP-2啟動子區(qū)上的IRE序列，負(fù)性調(diào)控SREBP-2的轉(zhuǎn)錄水平。這說明，糖代謝的調(diào)節(jié)因子可能也同時調(diào)節(jié)了脂代謝，為我們研究糖脂代謝共存的分子機(jī)制提供了可能性。
　　SREBP-2作為重要的調(diào)節(jié)膽固醇合成的因子。SREBP-2以前體的形式在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成，進(jìn)入到高爾基體后剪切成為具有轉(zhuǎn)錄活性的活性體形式。在細(xì)胞核中，成熟的SREBP-2控

6、制了涉及到多種膽固醇代謝的因子的轉(zhuǎn)錄，包括膽固醇從頭合成的限速酶HMGCR。SREBP-2的調(diào)控涉及到轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的修飾過程。SREBP-2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可通過其活性形式對其啟動子區(qū)SER序列的前反饋來實現(xiàn)，也可通過FoxO1對其啟動子區(qū)IRE序列的調(diào)控來完成。SREBP-2轉(zhuǎn)錄后的修飾包括裂解為活性形式的過程及乙?；凹谆男揎椀?。
　　本課題通過體內(nèi)外實驗證實了CRTC2的確能促進(jìn)肝臟中膽固醇的生成，并進(jìn)一步探討了CRTC2至少

7、部分通過FoxO1調(diào)節(jié)SREBP-2的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而影響膽固醇合成的限速酶HMGCR的分子機(jī)制。
　　目的:
　　1、明確在高膽固醇血癥患者及糖脂代謝紊亂共存的高脂小鼠模型中CRTC2及膽固醇合成相關(guān)因子的表達(dá)增加。
　　2、通過尾靜脈注射過表達(dá)CRTC2腺病毒的小鼠模型及CRTC2敲除的小鼠模型，證實CRTC2對血液及肝臟脂質(zhì)的影響，尤其對肝臟新生膽固醇的調(diào)節(jié)作用。
　　3、通過體內(nèi)外實驗證實CRTC2對肝臟中

8、HMGCR的上調(diào)作用。
　　4、通過尾靜脈注射過表達(dá)的CRTC2及SREBP-2干擾病毒的小鼠模型和細(xì)胞實驗，驗證CRTC2通過SREBP-2上調(diào)肝臟中HMGCR的表達(dá)。
　　5、證實CRTC2可減少細(xì)胞核內(nèi)FoxO1的表達(dá)，進(jìn)一步驗證CRTC2對SREBP-2轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)通過FoxO1來實現(xiàn)。
　　研究方法:
　　1、人肝臟標(biāo)本的獲得:山東省立醫(yī)院進(jìn)行肝血管瘤手術(shù)患者的肝臟標(biāo)本。
　　2、細(xì)胞培養(yǎng):HE

9、K293細(xì)胞，CHO細(xì)胞，BNL細(xì)胞及HepG2細(xì)胞根據(jù)ATCC細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行培養(yǎng)。
　　3、動物模型:
　　(1)建立高膽固醇小鼠模型:雄性C57BL/6J小鼠（6周-8周）高膽固醇飲食(HC-diet)及普通飲食(Chow-diet)喂養(yǎng)。
　　(2)過表達(dá)CRTC2及干擾SREBP-2病毒的小鼠模型:采用尾靜脈注射病毒的方式給與C57BL/6J雄性小鼠同時注射過表達(dá)CRTC2的腺病毒及干擾SREBP-2的慢病毒

10、。
　　(3)CRTC2-KO小鼠:在SPF環(huán)境飼養(yǎng)并采用雜合子繁殖同窩對照的野生型(CRTC2+/+，Wt)及敲除型(CRTC2-/-，KO)小鼠，經(jīng)鑒定后待雄性小鼠7周左右給與高膽固醇飲食(HC-diet)喂養(yǎng)18周或含有不同濃度膽固飲食喂養(yǎng)3天（0.02％，1％，4％膽固醇飲食）。
　　(4)CRTC2敲除小鼠高膽固醇飲食14周后，尾靜脈注射過表達(dá)CRTC2的腺病毒。
　　(5)注射過表達(dá)熒光素酶病毒的小鼠模型<

11、br>　　過表達(dá)腺病毒CRTC2及HMGCR-Luciferase小鼠模型:采用尾靜脈注射病毒的方式給與C57BL/6J雄性小鼠注射過表達(dá)CRTC2和陰性對照病毒的小鼠并同時注射Ad-HMGCR-Luciferase病毒。
　　注射SREBP-2-Luciferase小鼠模型:雄性CRTC2敲除小鼠(CRTC2-/-及CRTC2+/+)給與高膽固醇飲食18周后，尾靜脈注射腺病毒介導(dǎo)的SREBP-2-Luciferase。
　

12、　4、采用Real time-PCR檢測各因子基因水平的表達(dá):檢測CRTC2、HMGCR、FDPS、SS、 SREBP-2、LDLR、PEPCK、G6P、FAS、SREBP-1C、ABCA1、ACAT2、CYP7A1、FoxO1在小鼠肝臟及細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)變化。
　　5、采用Western Blotting檢測CRTC2、HMGCR、SREBP-2、PEPCK、CREB、p-CREB、FoxO1及Lamb和β-actin蛋白水平的變化

13、。
　　6、采用免疫熒光法檢測HMGCR在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，H&E染色了解小鼠肝臟脂肪變情況。
　　7、CRTC2及FoxO1基因沉默:采用脂質(zhì)體法以CRTC2及FoxO1特異性siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，以沉默CRTC2和FoxO1的表達(dá)。
　　8、血脂、血糖及肝功測定檢測指標(biāo):血脂（總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇）及血糖和ALT、AST，采用Mindrary全自動生化分析儀（山東省立醫(yī)院內(nèi)

14、分泌實驗室）檢測。
　　9、肝細(xì)胞內(nèi)及肝臟中總膽固醇(TTC)、游離膽固醇(FTC)的檢測:采用檢測試劑盒（北京普利萊公司），實驗操作按照說明書進(jìn)行定量測定。
　　10、肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇染色(Filipin):采用Filipin染色試劑盒（GENMED），實驗操作按照說明書進(jìn)行定量測定。
　　11、熒光素酶活性分析檢測指標(biāo):含有CRE及SRE結(jié)合位點及突變位點的HMGCR啟動子區(qū)域重組質(zhì)粒熒光素酶活性分析以及含有half

15、-site CRE、IRE-1、IRE-2位點及突變位點的SREBP-2啟動子區(qū)域重組質(zhì)粒熒光素酶活性分析。12、小動物活體成像:采用小動物活體成像儀檢測CRTC2對小鼠肝臟中HMGCR啟動子區(qū)及SREBP-2啟動子區(qū)的影響。
　　13、糖耐量試驗檢測小鼠糖代謝紊亂。
　　14、小鼠肝臟新生膽固醇的檢測:根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)檢測CRTC2對肝臟中新生膽固醇的調(diào)節(jié)。
　　15、CHIP分析CRTC2對FoxO1與SREBP-2啟

16、動子區(qū)結(jié)合的影響。
　　結(jié)果:
　　1、CRTC2在高膽固醇血癥患者肝臟中的表達(dá)增加
　　高膽固醇血癥患者血低密度脂蛋白(LDL-C)較血脂正常組患者增加明顯（P＜0.01）;而血甘油三酯(TG)及高密度脂蛋白(HDL-C)有增高的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異;肝臟中游離膽固醇(FTC)及總膽固醇(TTC)的含量在高膽固醇血癥患者中也有顯著增加，但是肝臟中TG的含量沒有統(tǒng)計學(xué)差異;Real-time PCR結(jié)果顯示高膽固醇血證

17、患者肝臟中CRTC2、SREBP-2、HMGCR的表達(dá)較正常組明顯增加;但是SREBP-1a、LXR、FoxO1、HMGCS及LDLR的表達(dá)與正常組比較沒有明顯差異。
　　2、CRTC2在高膽固醇小鼠模型肝臟中的表達(dá)增加
　　雄性C57BL/6J小鼠高膽固醇飲食20周后，體重與正常對照組飲食小鼠比較沒有明顯差異，而肝體比，空腹血糖和血脂水平明顯增加;肝臟中脂滴及FTC及TTC水平也增加明顯;同時，肝臟中基因及蛋白水平的CRT

18、C2及PEPCK的表達(dá)也有明顯增加(P＜0.01)。
　　3、CRTC2過表達(dá)和敲除對血脂、肝脂，尤其是肝臟新生膽固醇的影響
　　小鼠通過尾靜脈注射過表達(dá)的CRTC2腺病毒后，和對照組小鼠比較:體重，肝體比及空腹血糖水平增加，糖耐量試驗也存在異常;同時，血脂及肝臟中脂滴及FTC的水平也增加明顯。HepG2細(xì)胞過表達(dá)CRTC2后TC水平也有明顯增加;而CRTC2敲除小鼠(CRTC2-/-)給與高膽固醇喂養(yǎng)后18周后，與野生型(

19、CRTC2+/+)相比空腹血糖水平及糖耐量水平明顯降低。血脂水平減少的同時，肝臟體積也顯著減少;H&E染色顯示:CRTC2-/-小鼠肝臟中脂質(zhì)聚集減少，而肝臟中FTC的含量和CRTC2+/+小鼠比也有明顯減少;但是，我們紿與CRTC2-/-小鼠注射過表達(dá)的CRTC2病毒后，肝臟中FTC水平較注射對照組病毒明顯增加。同時，我們觀察到過表達(dá)CRTC2小鼠肝臟中新生膽固醇水平與對照組比有明顯增加(P＜0.01)。
　　4、體內(nèi)外實驗證實

20、CRTC2對肝臟中HMGCR的上調(diào)作用
　　檢測過表達(dá)CRTC2的小鼠肝臟基因水平發(fā)現(xiàn):HMGCR，F(xiàn)DPS， SS，ABCA1及PEPCK在過表達(dá)小鼠組中明顯增加，而ACAT2則減少明顯;同日寸檢測到過表達(dá)CRTC2的HepG2細(xì)胞中CRTC2，HMGCR，PEPCK和G6P的表達(dá)明顯增加;小動物活體成像結(jié)果顯示:過表達(dá)CRTC2后小鼠HMGCR熒光素酶的活性和對照組比較增加明顯。而在CRTC2敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)基因水平的HMGCR

21、，HMGCS，SS，LDLR，ABCA1，ACAT2及PEPCK的基因水平有顯著減少;蛋白水平的結(jié)果顯示:過表達(dá)CRTC2小鼠肝臟中CRTC2增加的同時，HMGCR及PEPCK的表達(dá)也有顯著增加;相反，CRTC2敲除小鼠肝臟中蛋白水平的CRTC2及HMGCR、PEPCK的表達(dá)明顯降低;而干擾掉CRTC三后，免疫熒光檢測到HepG2細(xì)胞中HMGCR的表達(dá)明顯降低。
　　5、CRTC2通過SREBP-2上調(diào)肝臟中HMGCR的表達(dá)

22、>　　熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示HMGCR-Luciferase分別突變SRE及CRE位點后，CRTC2引起的HMGCR的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)降低;過表達(dá)CRTC2的小鼠肝臟中SREBP-2基因及蛋白水平（前體及成熟體）的增加明顯;HepG2細(xì)胞中過表達(dá)CRTC2后與動物實驗的結(jié)果類似。而HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源性的Flag-SREBP-2質(zhì)粒后，CRTC2呈劑量依賴性的增加外源性的SREBP-2前體及成熟體的增加。相反，CRTC2敲除后，小鼠肝臟

23、中SREBP-2的基因及蛋白水平（前體及成熟體）的表達(dá)均下降。給與過表達(dá)CRTC2病毒引起的小鼠肝臟中SREBP-2蛋白及基因水平增加的同時再給與SREBP-2 siRNA干擾病毒注射后，SREBP-2的表達(dá)明顯減少。
　　6、CRTC2通過減少FoxO1的入核，上調(diào)SREBP-2的轉(zhuǎn)錄水平
　　CRTC2敲除及野生型小鼠尾靜脈注射SREBP-2-1uciferase病毒后進(jìn)行活體成像，結(jié)果顯示:CRTC2敲除小鼠SREBP

24、-2-1uciferase的活性與野生型比較明顯降低;CHIP結(jié)果顯示:CRTC2過表達(dá)的細(xì)胞中，F(xiàn)oxO1與SREBP-2啟動子區(qū)的結(jié)合明顯減少。同時，我們觀察到:轉(zhuǎn)錄抑制劑-放線菌素D(actinomycinD)可明顯抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)CRTC2及SREBP-2在基因水平的表達(dá);同時給與過表達(dá)的CRTC2及放線菌素D后，CRTC2引起的SREBP-2的表達(dá)也被抑制。SREBP-2-1uciferase啟動子區(qū)上突變CRE位點后，C

25、RTC2對其激活作用減弱，但未完全阻斷;同時我們觀察到HepG2細(xì)胞進(jìn)行FoxO1干擾后，基因水平的SREBP-2表達(dá)明顯增加。CRTC2敲除小鼠肝臟中基因水平的FoxO1表達(dá)無明顯變化，但是核蛋白水平的FoxO1表達(dá)明顯增加。在BNL及HepG2細(xì)胞中過表達(dá)CRTC2后，基因水平的FoxO表達(dá)無明顯變化，但蛋白水平的FoxO1表達(dá)明顯減少。熒光素酶檢測CRTC2對SREBP-2啟動子區(qū)FoxO1的特異識別序列IRE發(fā)現(xiàn):在SREBP-

26、2-1uciferase突變IRE1位點后，CRTC2對SREBP-2轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)作用明顯增加，而突變IRE2位點后，沒有明顯的改變。
　　7、CRTC2在不同濃度膽固醇飲食的小鼠模型中調(diào)節(jié)SREBP-2的活性
　　CRTC2敲除的小鼠給與不同濃度膽固醇飲食喂養(yǎng)3天后，肝臟成熟體水平的SREBP-2隨著膽固醇濃度的增加而降低。同時，基因水平SREBP-2、HMGCR、HMGCS和LDLR也隨著膽固醇濃度的增加而減少;但是肝

27、臟中TTC及FTC的含量隨著膽固醇濃度的增加而增加。
　　結(jié)論:
　　1、高膽固醇血癥患者及高膽固醇模型小鼠肝臟中CRTC2的表達(dá)明顯增加。
　　2、CRTC2的確能影響肝臟脂質(zhì)水平尤其是肝臟新生的膽固醇的水平，并且對新生膽固醇的調(diào)節(jié)可通過HMGCR來實現(xiàn)。
　　3、CRTC2通過SREBP-2調(diào)節(jié)HMGCR的表達(dá)進(jìn)而影響肝臟膽固醇的合成。
　　4、CRTC2通過FoxO1識別SREBP-2啟動子區(qū)IRE1

28、的結(jié)合位點，進(jìn)而啟動SREBP-2的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。
　　論文二 TSH通過上調(diào)肝臟中CRTC2的表達(dá)促進(jìn)肝臟糖異生的研究
　　研究背景:
　　亞臨床甲減(SCH)是一種常見的危害人類健康的分泌疾病，在人群中發(fā)病率為4-10％。SCH與高血壓、高脂血癥、代謝綜合癥、動脈粥樣硬化、心血管疾病密切相關(guān)。但是，目前的研究發(fā)現(xiàn)，SCH與糖尿病也具有密切的相關(guān)性。糖尿病患者合并SCH的機(jī)率為4-17％，并且糖尿病患者合并SCH后可加劇

29、其病情及并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn):糖尿病及糖尿病前期的患者合并SCH與無SCH的患者比較其腎功能異常及糖尿病腎病的發(fā)生率大大增加。糖尿病合并SCH的患者控制血糖的同時，良好的TSH水平的控制對于患者也十分重要。因此，探討TSH對血糖的調(diào)節(jié)機(jī)制對糖尿病患者合并亞臨床甲減患者的治療十分重要。
　　CRTC2是重要的調(diào)節(jié)糖代謝的因子，在維持機(jī)體血糖穩(wěn)態(tài)的過程中起了重要的作用。CRTC2可受到cAMP升高的因素如胰高血糖素調(diào)節(jié)后，激活

30、糖異生的重要酶PEPCK及G6P從而增加糖異生能力，提高血糖水平;而當(dāng)機(jī)體禁食后，機(jī)體胰島素水平增加，從而抑制CRTC2的活性，降低糖異生基因的表達(dá)，導(dǎo)致機(jī)體血糖水平下降。SCH患者的特征性表現(xiàn)促甲狀腺激素(TSH)水平升高，而甲狀腺激素(T4、T3)水平正常。研究發(fā)現(xiàn):TSH與血糖水平也具有正相關(guān)性。而我們前期的研究看到:TSH在不同的組織細(xì)胞內(nèi)可以增加cAMP的水平，導(dǎo)致脂代謝的異常。但是，目前對于TSH升高血糖的分子機(jī)制的研究還不

31、甚清楚，尤其是TSH對于血糖的影響是否通過CRTC2來實現(xiàn)，目前尚無相關(guān)報道。
　　本項目證實從體內(nèi)外證實:TSH可以調(diào)節(jié)肝細(xì)胞內(nèi)CRTC2的表達(dá)，并且該作用依賴于肝細(xì)胞膜上TSHR來實現(xiàn)。TSH通過CRTC2增加肝臟糖異生的能力，其機(jī)制是-TSH結(jié)合肝細(xì)胞膜上的TSHR，引起cAMP的產(chǎn)生增加，導(dǎo)致CRTC2脫磷酸增加，從而引起糖異生的關(guān)鍵酶PEPCK和G6P的轉(zhuǎn)錄活性增加，促進(jìn)肝臟的糖異生水平，從而增加血糖水平。
　　目

32、的:
　　1、通過構(gòu)建SCH模型小鼠，確定SCH小鼠糖代謝水平異常及糖異生關(guān)鍵酶的表達(dá)上調(diào)。
　　2、確定CRTC2在SCH小鼠及TSH處理HepG2細(xì)胞中表達(dá)增加。
　　3、通過CRTC2基因敲除小鼠及siRNA CRTC2明確CRTC2在TSH引起的肝臟糖異生過程中發(fā)揮了重要作用。
　　4、通過TSHR基因敲除小鼠及siRNA TSHR探討TSH對CRTC2的調(diào)節(jié)依賴于TSHR來實現(xiàn)。
　　5、使用cA

33、MP的激動劑及抑制劑和PAK的阻斷劑觀察TSH對CRTC2的調(diào)控機(jī)制。
　　6、明確TSH與CREB∶CRTC2復(fù)合體的影響。
　　研究方法:
　　1、細(xì)胞培養(yǎng):(1) HepG2細(xì)胞根據(jù)ATCC細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行培養(yǎng)(2)小鼠肝原代細(xì)胞據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)提取，培養(yǎng)基中加轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、地塞米松。
　　2、動物模型:(1)通過飲水給與他巴唑建立SCH模型。(2)繁殖及飼養(yǎng)TSHR-KO和CRTC2-KO小鼠。
　　

34、3、采用Real time-PCR檢測PEPCK、G6P、TSHR、CRTC2基因的表達(dá)。
　　4、采用Western Blotting檢測PEPCK、G6P、TSHRCRTC2、CREB及beta-actin蛋白水平變化。
　　5、采用免疫熒光及免疫組化檢測CRTC2在肝臟組織及細(xì)胞中的表達(dá)。
　　6、TSHR、CREB、CRTC2基因沉默:特異性siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞以沉默TSHR、CREB、CRTC2表達(dá)。

35、
　　7、采用尾靜脈測血糖的方法檢測SCH模型小鼠OGTT及PTT實驗。
　　8、采用氧化酶法檢測HepG2細(xì)胞中葡萄糖的含量。
　　9、熒光素酶活性分析檢測指標(biāo):含有CRE結(jié)合位點的PEPCK啟動子區(qū)域重組質(zhì)粒熒光素酶活性分析。
　　10、耐量試驗:小鼠給與口服葡萄糖耐量試驗、丙酮酸耐量試驗，觀察SCH小鼠整體糖代謝水平的影響。
　　11、細(xì)胞糖原磷酸化酶a活性分析。
　　結(jié)果:
　　1、促甲

36、狀腺激素增加血糖水平:他巴唑喂養(yǎng)14周，SCH組小鼠血清中TSH水平較對照組明顯增加，而FT3和FT4水平無明顯差異; SCH組小鼠糖代謝異常，空腹血糖水平增加，OGTT及PTT各時間點血糖水平較正常組增加;SCH肝臟中基因水平的PEPCK及G6P無論在空腹還是禁食又給食后均比正常組增加（P＜0.01）;蛋白水平的PEPCK及G6P結(jié)果與基因水平變化相似。但是，負(fù)責(zé)肝臟中糖原分解的Gpa的活性在過表達(dá)CRTC2的肝細(xì)胞和正常對照組之間沒

37、有明顯差異。
　　2、促甲狀腺激素對CRTC2的上調(diào)作用:免疫組化及Western blotting結(jié)果顯示:CRTC2在SCH小鼠肝臟中表達(dá)較正常組增加。而HepG2細(xì)胞給予Glucgaon和TSH處理后也明顯增加CRTC2的表達(dá)，但是TSH對CRTC2的增強(qiáng)作用在加入Insulin處理后削弱。進(jìn)一步采用免疫熒光技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)TSH除了能增加HepG2細(xì)胞中CRTC2的表達(dá)外還能明顯促進(jìn)其入核。TSH對CRTC2的促進(jìn)作用可通過脫

38、磷酸化CRTC2的(S171)及(S136)位點來實現(xiàn)。
　　3、CRTC2介導(dǎo)了促甲狀腺激素引起的糖異生水平的上調(diào):CRTC2敲除后，小鼠肝臟原代細(xì)胞中TSH處理48小時后，對PEPCK及G6P的基因及蛋白水平的上調(diào)作用較野生型比較明顯降低;siRNA干擾掉CRTC2后，TSH對PEPCK啟動子區(qū)的調(diào)節(jié)作用較對照組明顯降低，但比單純干擾CRTC2的組還要高些;同時，檢測TSH對肝細(xì)胞中糖輸出的影響發(fā)現(xiàn):TSH能明顯增加肝細(xì)胞中糖

39、的輸出，而CRTC2干擾后減弱了TSH的作用，但是沒有完全阻斷。
　　4、TSH對肝臟中CRTC2的調(diào)節(jié)依賴于肝臟的TSHR:TSHR基因敲除小鼠肝臟中CRTC2蛋白水平的含量較同窩對照野生型比明顯下降，而同時給與TSHR基因敲除小鼠肝臟原代細(xì)胞TSH處理48 h后發(fā)現(xiàn):野生型小鼠肝原代細(xì)胞中CRTC2的表達(dá)含量隨著TSH濃度的增加呈劑量依賴性增加的趨勢，而敲除型肝原代細(xì)胞中CRTC2的表達(dá)則無明顯變化。同時我們觀察到HepG2細(xì)

40、胞中給與TSHR干擾后，TSHR基因水平較正常組下降約60％（P＜0.01），CRTC2下降約35％，并且TSH與siRNA TSHR共同孵育后，CRTC2的表達(dá)量與siRNA TSHR組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　5、TSH通過cAMP/PKA信號通路調(diào)節(jié)肝臟的CRTC2: TSH和FSK能明顯增加HepG2細(xì)胞中CRTC2蛋白水平，SQ22526可削弱TSH對CRTC2的增加作用;同時我們觀察到H89也能明顯降低TSH對CRTC2

41、的上調(diào)作用;在TSHR敲除小鼠給與Forskolin腹腔注射后發(fā)現(xiàn)蛋白水平的CRTC2無論野生型還是敲除型與其基因型一致的PBS對照組相比均有明顯的增加;同時TSHR敲除小鼠給與H89腹腔注射后發(fā)現(xiàn)mRNA水平的CRTC2無論是野生型還是敲除型小鼠與其基因型一致的PBS對照組比較均有明顯的下降;胞漿蛋白中PEPCK和G6P的表達(dá)在H89處理后明顯減少，而p-CRTC2的表達(dá)量明顯增加;胞核蛋白結(jié)果顯示:CRTC2在H89處理后無論是野生

42、型還是敲除型小鼠肝臟中CRTC2的表達(dá)量與其同基因型的PBS對照組相比均明顯下降。
　　6、TSH通過CREB∶CRTC2復(fù)合物通路調(diào)節(jié)肝臟PEPCK的表達(dá):TSH呈劑量依賴性的增加細(xì)胞中p-CREB(S133)的表達(dá);而干擾CREB后PEPCK熒光素酶的活性明顯降低，并且CREB干擾后可明顯降低TSH對PEPCK熒光素酶活性的上調(diào)作用。CRTC2過表達(dá)明顯增加PEPCK熒光素酶的活性，但是突變PEPCK啟動子區(qū)CRE位點后其活性

43、明顯減低;CO-IP結(jié)果顯示:TSHR敲除小鼠肝臟中CRTC2與CREB復(fù)合體較野生型比較明顯減少。
　　結(jié)論:
　　1、SCH小鼠出現(xiàn)糖代謝紊亂及糖異生基因水平的表達(dá)增加。
　　2、TSH通過脫磷酸化的方式促進(jìn)肝中CRTC2的表達(dá)，并且對肝臟糖異生水平的調(diào)節(jié)通過CRTC2來實現(xiàn)。
　　3、TSH通過TSHR/cAMP/PKA信號通路促進(jìn)肝臟中CRTC2的表達(dá)。
　　4、TSH通過調(diào)節(jié)CREB∶CRTC2復(fù)