蘆丁抗紫外線照射所致皮膚光損傷的防護作用及其機制的研究.pdf

1、前言:皮膚的衰老分為內(nèi)源性老化(endogenous aging)和外源性老化(extraneousaging)。內(nèi)源性老化又叫自然老化，是自然的衰老過程；外源性老化主要由外界環(huán)境因素引起，皮膚作為被覆于機體表面的最大器官，它直接受到紫外線的輻射，因而紫外線(ultraviolet UV)輻射是外源性老化的主要因素，自然界中的UV主要來源于太陽光輻射，所以外源性老化又稱為光老化。UV是波長為200～400nm的電磁波，根據(jù)其波長不同又分

2、為波長為320～400nm的長波紫外線(UVA)、波長為280～320nm中波紫外線(UVB)和波長為200～280nm的短波紫外線(UVC)。在劑量相同的情況下，UVC對皮膚的損害性最強，其次是UVB，研究表明相同劑量的UVB對皮膚的損傷強度比UVA強約800～1000倍。在三個波段的紫外線中，UVA的穿透性最強，能穿透真皮層，其次是UVB，它僅能照射至表皮層幾毫米，UVC穿透性最弱，在穿過大氣層時幾乎全被臭氧層吸收，自然情況下基本達

3、不到地面。從量上來看，天然的紫外線中UVA的量最大，約占91～99％，UVB僅占少量。因此綜合看來光損傷主要由UVA和UVB引起，而UVB是最主要的因素。許多研究表明紫外線對皮膚的損傷與其產(chǎn)生的活性氧簇(ROS)造成的氧化應(yīng)激(oxidative stress)有關(guān)。正常情況下，ROS能被皮膚細胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)(包括抗氧化酶和抗氧化劑等)轉(zhuǎn)化、消除掉，當紫外線的照射過量時，皮膚內(nèi)產(chǎn)生較多的ROS，體內(nèi)的氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡遭到破壞，這

4、些ROS則可引起皮膚組織內(nèi)脂質(zhì)、DNA、蛋白質(zhì)等成分的損傷，破壞皮膚細胞的結(jié)構(gòu)及各種生物代謝功能，從而引起光老化，誘發(fā)皮膚癌等。近半個世紀以來由于臭氧層被破壞，紫外線照射到地面上的強度增大，光損害性皮膚病逐漸增多。因此開發(fā)具有高活性成分的防曬產(chǎn)品抵抗紫外線的輻射，預(yù)防和延緩皮膚衰老已成為目前醫(yī)學研究的熱點。近年來報道了許多抗氧化劑，如抗壞血酸、黃芪甲甙、石榴素、維生素E和B-胡蘿卜素等，它們在動物實驗及細胞實驗中均顯示有很好的抗紫外線損

5、傷作用。因此抗氧化劑的應(yīng)用已成為人們減輕紫外線照射所致皮膚病的有效選擇。
　　 蘆丁(Rutin)又名蕓香苷，是一種來源廣泛的黃酮類化合物。它主要存在于植物中，具有抗菌消炎、降低毛細血管壁脆性及滲透性、止血、抗氧化和對紫外線具有較強的吸收作用等。目前臨床上主要應(yīng)用于血管性疾病等的治療。因為蘆丁是天然、安全的抗氧化劑，可以考慮用作防曬劑。
　　 目的:
　　 1.觀察不同濃度的蘆丁溶液對HaCaT細胞增殖活力的影響

6、。
　　 2.建立UVB照射HaCaT細胞的光損傷模型。
　　 3.觀察不同濃度的蘆丁溶液對UVB照射后HaCaT細胞增殖活力的影響。
　　 4.觀察不同濃度的蘆丁溶液對UVB照射后HaCaT細胞凋亡率的影響。
　　 5.觀察不同濃度的蘆丁溶液對UVB照射后HaCaT細胞分泌 TNF-α、IL-6水平的影響。
　　 方法：
　　 1.觀察不同濃度的蘆丁溶液對HaCaT細胞增殖活力的影響

7、r>　　 1.1 HaCaT細胞的培養(yǎng)：用含10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2、飽和濕度條件下將HaCaT、細胞培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)箱中。
　　 1.2 HaCaT細胞的分組：Ⅰ組為正常對照組，不照射UVB，不加入蘆丁溶液Ⅱ組為照射對照組，不加蘆丁溶液Ⅲ組為基質(zhì)(DMSO)對照組，培養(yǎng)基含基質(zhì)DMSO，不含蘆丁Ⅳ組為含12.5umol/l蘆丁培養(yǎng)基的實驗組Ⅴ組為含25

8、.0umol/l蘆丁培養(yǎng)基的實驗組Ⅵ組為含50.0umol/l蘆丁培養(yǎng)基的實驗組Ⅶ組為含100.0 umol/l蘆丁培養(yǎng)基的實驗組1.3 MTT法檢測不同濃度的蘆丁溶液對HaCaT細胞增殖活力的影響去除細胞培養(yǎng)基，用PBS沖洗1次后，每孔加入5mg/ml的MTT20μ l，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，加DMSO200μ l溶解，室溫震蕩搖勻15分鐘，用酶標儀在490nm波長處檢測各孔的吸光度A值。
　　 2.HaCaT細胞UVB照射

9、后光損傷模型的建立
　　 2.1紫外線光源的參數(shù)：UVB燈管，波長范圍290～320nm，峰值312nm，9W，8支，輻照距離為15cm，該處UVB輻射強度為0.75mW/cm2。輻射時間(s)=輻射劑量(mJ/cm2)/輻射強度(mW/cm2)。
　　 2.2 UVB照射HaCaT細胞：觀察HaCaT細胞在96孔培養(yǎng)板上生長到每孔融合至80～90％時，將其從培養(yǎng)箱中取出。除Ⅰ組(正常對照組)外，Ⅱ～Ⅶ組均照射UVB，照

10、射劑量為30mJ/cm2，細胞距光源的垂直距離為15cm。
　　 3.MTT法檢測：UVB照射后HaCaT細胞的增殖活力UVB照射后更換新的培養(yǎng)基后置于37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，3板分別培養(yǎng)12h、24 h、48 h后收集細胞，然后每孔加入5mg/ml的MTT20μl，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，棄上清液，再加入DMSO200μl搖勻15分鐘，用酶標儀測490nm波長處的吸光度A值。
　　 4.Annexin

11、V-FITC/PI雙染法流式細胞儀檢測不同濃度的蘆丁溶液對UVB照射后HaCaT細胞凋亡率的影響：UVB照射方法同2.2，照射后更換新的培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，收集細胞并經(jīng)消化、離心，用預(yù)冷的PBS清洗兩次，濾網(wǎng)過濾，去除未完全消化細胞團塊，調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml。加入Annexin V-FITC5μl和PI2.5μl于流式管中，用流式細胞儀分析檢測。
　　 5.ELISA法檢測不同濃度的蘆丁溶液對UVB照射后

12、HaCaT細胞分泌IL-6和TNF-α的影響：UVB照射后后更換新的培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，收集細胞培養(yǎng)液，離心取上清，使用ELISA試劑盒，嚴格按照操作說明書檢測TNF-α、IL-6的分泌量。
　　 結(jié)果：
　　 1.不同濃度的蘆丁溶液對HaCaT細胞增殖活力的影響：Ⅲ～Ⅶ組與Ⅰ組比較吸光度A值相仿，差異無統(tǒng)計學意義。本實驗結(jié)果表明，在12.5～100.0μmol/l濃度范圍的蘆丁溶液對HaCaT細胞增殖活力無

13、顯著性影響，DMSO基質(zhì)對HaCaT細胞增殖活力亦無顯著性影響。
　　 2.MTT法檢測不同濃度的蘆丁溶液對UVB照射后HaCaT細胞增殖活力的影響：UVB照射后的各組HaCaT細胞的增殖活力均顯著降低。濃度在25～100μmol/l的蘆丁可以顯著提高UVB照射后HaCaT細胞的增殖活力，12.5μmol/l的蘆丁組及基質(zhì)組對UVB照射后HaCaT細胞增殖活力無顯著性影響。UVB照射后Ⅱ～Ⅶ組同一組MTT12、MTT24、MTT

14、48相比較，HaCaT細胞的增殖活力隨著時間的延長而降低，其差異有統(tǒng)計學意義。正常對照組MTT12、MTT24、MTT48兩兩比較，HaCaT細胞的增殖活力無明顯改變，其差異無統(tǒng)計學意義。
　　 3.不同濃度的蘆丁溶液對UVB照射后HaCaT細胞凋亡率的影響：UVB照射后的各組HaCaT細胞的凋亡率均顯著升高；濃度在12.5～100 umol/l的蘆丁可以顯著降低UVB照射后HaCaT細胞的凋亡率；基質(zhì)組對UVB照射后HaCaT

15、細胞的凋亡率無顯著性影響。Ⅳ～Ⅶ組的HaCaT細胞凋亡率與蘆丁藥物濃度成負相關(guān)。
　　 4.ELISA法檢測不同濃度的蘆丁溶液對UVB照射后HaCaT細胞分泌IL-6和TNF-α的影響：UVB照射后的各組HaCaT細胞分泌IL-6和TNF-α的量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義；Ⅳ～Ⅶ組HaCaT細胞IL-6、TNF-α的分泌量隨著蘆丁藥物濃度的增加而降低，且HaCaT細胞IL-6、TNF-α的分泌量與蘆丁藥物濃度成負相關(guān)。

16、>　　 結(jié)論：本實驗表明：蘆丁在一定濃度范圍內(nèi)對UVB照射損傷的HaCaT細胞有一定的防護作用，該作用隨蘆丁濃度的升高而升高，這可能與蘆丁可以提高UVB照射后HaCaT細胞增殖活力、降低HaCaT細胞的凋亡率、抑制細胞因子IL-6和 TNF-α的分泌量有關(guān)。
　　 第二部分蘆丁制劑對紫外線所致昆明小鼠皮膚光損傷的防護作用其機制
　　 目的：
　　 1.建立光老化昆明小鼠模型。
　　 2.觀察昆明小鼠外用

17、蘆丁制劑后UVA+UVB照射對皮膚外觀狀態(tài)的影響。
　　 3.觀察昆明小鼠外用蘆丁制劑后UVA+UVB照射對皮膚組織形態(tài)學的影響。
　　 4.觀察昆明小鼠外用蘆丁制劑后UVA+UVB照射對皮膚丙二醛含量及抗氧化酶活性的影響。
　　 5.觀察昆明小鼠外用蘆丁制劑后UVA+UVB照射對皮膚MMP-1 mRNA水平的影響。
　　 方法：1.光老化昆明小鼠模型的建立
　　 1.1實驗動物及動物分組：清潔級

18、白色昆明小鼠60只，雌雄各半，體重20～25 g，鼠齡6～8周，購自山東中醫(yī)藥大學醫(yī)學實驗動物中心，在普通級動物飼養(yǎng)房內(nèi)飼養(yǎng)，每籠6只，同性別飼養(yǎng)。實驗開始后，將昆明小鼠隨機分成5組：每組12只，雌雄各半：A組：基質(zhì)對照組(不照射紫外線)B組：蘆丁對照組(不照射紫外線)C組：UVA+UVB照射組D組：UVA+UVB照射+基質(zhì)組E組：UVA+UVB照射+蘆丁組。
　　 1.2紫外線照射前準備SS-04型臺式紫外線光療儀，安裝有UV

19、A燈管9支，每支15W，波長范圍320～400nm，照射高度為15cm。另有UVB燈管4支，40W，波長范圍290～320nm，將4支燈管制成燈箱，照射高度為50cm。
　　 1.3造模及給藥方法：用嬰兒理發(fā)器剃除小鼠背部的絨毛，照射前1小時外涂受試樣品。除A、B組外，其余三組前3周均隔日照射UVA+UVB1次，每次先在距光源50cm處先進行UVB照射，每次劑量為50mJ/cm2，然后進行UVA照射，光源高度為15cm，每次劑量

20、為10J/cm2。第4周起每日照射1次，連續(xù)UVB+UVA照射共14周，113次，UVB總劑量為5.65J/cm2，UVA總劑量為1330J/cm2。
　　 2.昆明小鼠照射紫外線后膚外觀狀態(tài)變化的檢測：在照射過程中，每周觀察實驗組、對照組昆明小鼠背部皮膚，試驗結(jié)束后根據(jù)評分標準進行評分。
　　 3.昆明小鼠皮膚組織形態(tài)學改變及真皮內(nèi)膠原纖維和彈力纖維改變的檢測：末次UVA+UVB照射實驗結(jié)束后，處死小鼠，取背部照射區(qū)部

21、分皮膚組織，制片后分別進行HE染色、Van Gieson(VG)染色、Weigert染色，在顯微鏡下觀察小鼠皮膚組織形態(tài)學的改變及真皮內(nèi)膠原纖維和彈力纖維的變化。
　　 4.昆明小鼠皮膚丙二醛(MDA)含量及抗氧化酶活性的測定
　　 4.1組織勻漿的制備：末次UVA+UVB照射實驗結(jié)束后，處死小鼠，取昆明小鼠背部照射區(qū)部分皮膚，去除皮下脂肪稱重，制成10％組織勻漿，以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心10分鐘，取上清液進行各指標

22、測定。
　　 4.2昆明小鼠皮膚MDA含量的測定：嚴格按MDA試劑盒說明書操作上樣，充分混勻，95℃水浴放置40分鐘，取出后流水冷卻，然后以3500轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心10分鐘，取上清液，分光光度計于532nm處比色，測各管的吸光度A值。
　　 4.3超氧化物歧化酶(SOD)活性的檢測：嚴格按SOD試劑盒說明書操作，分光光度計于波長550nm處比色，測各管吸光度A值。
　　 4.4谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)

23、活性檢測：嚴格按GSH-Px試劑盒說明書操作，分光光度計于波長412nm處比色，測各管吸光度A值。
　　 5.熒光實時定量POR(Real-Time Quantitative-PCR)檢測紫外線照射后昆明小鼠皮膚中MMP-1mRNA水平。
　　 末次UVA+UVB照射實驗結(jié)束后，處死小鼠，取昆明小鼠背部照射區(qū)部分皮膚，冷凍勻漿，應(yīng)用試劑提取總RNA，分光光度計測定RNA濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，通過Real-T

24、ime q-PCR技術(shù)測定MMP-1 mRNA水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.昆明小鼠皮膚外觀狀態(tài)的變化：未經(jīng)紫外線照射的A組與B組相比較，昆明小鼠的皮膚外觀評分無明顯改變。照射組(C、D、E組)與未照射組(A、B組)相比較，昆明小鼠的皮膚外觀評分均明顯增高；C組(照射組)與D組(照射+基質(zhì)組)比較，昆明鼠的皮膚外觀評分無明顯改變；C、D組與E組(照射+蘆丁組)比較，昆明小鼠的皮膚外觀評分明顯增高。
　　 2.昆

25、明小鼠皮膚組織形態(tài)學改變及真皮內(nèi)膠原纖維和彈力纖維改變的檢測：A和B組：小鼠皮膚表皮層結(jié)構(gòu)完整，較薄，細胞分層清晰，具有明顯的表皮乳突及真皮乳頭；真皮層可見波浪狀膠原纖維組織，膠原纖維的粗細及分布皆均勻，沒有明顯斷裂及排列紊亂現(xiàn)象；真皮淺層彈力纖維與表皮平行排列，粗細均勻。C和D組：表皮厚度不一，角化過度，表皮層常有部分脫落，乳頭層變平，真皮層變厚明顯；真皮內(nèi)膠原纖維增粗、常有斷裂現(xiàn)象，且排列紊亂；彈力纖維增多、變粗，部分增生的彈力纖維

26、斷裂、纏結(jié)；炎性細胞浸潤多見，皮脂腺不規(guī)則增生。E組：其組織學改變位于A、B組及C、D組之間。
　　 3.昆明小鼠皮膚MDA含量的測定：C、D、E組昆明小鼠UVA+UVB照射后皮膚MDA含量均顯著升高，與未經(jīng)照射的A、B組比較差異均有統(tǒng)計學意義，其中C、D組昆明小鼠UVA+UVB照射后皮膚MDA含量升高最明顯，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義；E組MDA含量升高低于C、D組，差異有統(tǒng)計學意義；A和B組MDA含量相仿，兩組比較差異無統(tǒng)計學

27、意義。
　　 4.昆明小鼠皮膚抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性的檢測C、D組昆明小鼠UVA+UVB照射后皮膚抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性均顯著降低，與A和B組比較差異有統(tǒng)計學意義，A、B組抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性均相仿，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義。C、D組昆明小鼠抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性均相仿，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義，E組抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性均高于C、D組，差異有統(tǒng)計學意義。
　　

28、 5.實時熒光定量PCR(Real-Time Quantitative-PCR)檢測紫外線照射后昆明小鼠皮膚中MMP-1 mRNA水平。
　　 C、D、E組昆明小鼠UVA+UVB照射后皮膚MMP-1mRNA水平均顯著升高，與未被照射的A、B組比較差異有統(tǒng)計學意義，其中C、D組昆明小鼠照射后皮膚MMP-1 mRNA水平升高最明顯，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義，E組MMP-1 mRNA水平低于C、D組，差異有統(tǒng)計學意義，A和B組MMP