ALA介導的光動力療法誘導皮膚癌A375細胞與A431細胞凋亡機制的研究.pdf

1、目的:
　　研究5-α氨基酮戊酸（ALA）介導的光動力療法（ALA-PDT）對皮膚癌A375細胞與A431細胞的殺傷作用及其誘導其凋亡機制，為ALA-PDT應用于臨床提供治療參數和理論依據。
　　方法：
　　以皮膚黑色素瘤A375細胞與鱗狀細胞癌A431細胞為研究對象；
　　1.研究ALA-PDT對皮膚癌細胞的殺傷作用，A375細胞與A431細胞與不同的ALA濃度孵育，在PDT作用后不同的時間，用噻唑藍法（MTT

2、）法檢測其增殖抑制率。
　　2.研究ALA-PDT誘導A375細胞與A431細胞發(fā)生凋亡機制。首先用TUNEL染色法分析ALA-PDT作用后A375細胞與A431細胞的凋亡率；接著，用Western-blot方法檢測ALA-PDT后兩株細胞凋亡過程中，外源性凋亡途徑相關蛋白Caspase8，線粒體凋亡途徑相關蛋白Bcl-2，Bax與Caspase9以及Caspase3與PARP的表達情況；最后，用免疫組化法檢測A375細胞與A43

3、1細胞在ALA-PDT作用前后細胞色素c（Cyt-c）在細胞內的分布情況，旨在從內源性與外源性途徑揭示ALA-PDT誘發(fā)皮膚癌細胞凋亡機制。
　　結果：
　　1.MTT比色法結果顯示不同濃度的ALA-PDT組對A375細胞與A431細胞均有殺傷作用，并與ALA藥物濃度和ALA-PDT作用后的時間密切相關，在0.4mmol/L ALA-PDT作用后4h，對A375細胞的增殖抑制作用達到最大程度；在0.6mmol/L ALA-P

4、DT作用后8h，對A431細胞的增殖抑制作用達到最大程度，趨于平衡。
　　2.TUNEL染色結果顯示ALA-PDT作用后陽性反應在細胞核染色質濃縮區(qū)出現(xiàn)棕黃色沉淀反應，即細胞發(fā)生凋亡，且呈時間依賴性增加。A375細胞在ALA-PDT作用后0.5h，1h，2h，4h與6h的凋亡率分別是11.79％，44.84%，63.75%，75.33%與90%。A431細胞在ALA-PDT作用后1h，2h，4h，6h與8h的凋亡率分別是10%，2

5、5%，55.5%，61.54%與70%。
　　3.Western blot的檢測結果顯示ALA-PDT作用激活了A375細胞與A431細胞的外源性凋亡途徑和線粒體凋亡途徑，啟動了Bcl-2家族及Caspase家族參與凋亡過程。隨著ALA-PDT作用后孵育時間的延長，抗凋亡蛋白Bcl-2下調，促凋亡蛋白Bax上調;出現(xiàn)Caspase蛋白的級聯(lián)反應及剪切。A375細胞在ALA-PDT作用后0.5h，1h與2h出現(xiàn)Caspase3，8與

6、9剪切體且上調；但是在ALA-PDT作用后4h與6h上述剪切體下調。A431細胞在ALA-PDT作用后1h，2h與4h出現(xiàn)上述剪切體且上調；但是ALA-PDT作用后6h與8h上述剪切體下調；而且，ALA-PDT作用后，A375細胞與A431細胞出現(xiàn)PARP前體的下調和剪切體的上調，最終導致細胞凋亡。
　　4.Cyt-c免疫組化結果顯示ALA-PDT作用前，陽性反應在皮膚癌A375細胞與 A431細胞胞質核周出現(xiàn)棕黑色沉淀；ALA-