一氧化氮在ALA光動力誘導(dǎo)人皮膚鱗癌A431細(xì)胞凋亡中的作用研究.pdf

1、目的:
　　探索5-氨基酮戊酸光動力(5-aminolevulinic acid photodynamic therapy, ALA-PDT)誘導(dǎo)人皮膚鱗癌A431細(xì)胞凋亡過程中NO的作用，以深入認(rèn)識ALA-PDT治療鱗狀細(xì)胞癌的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1、培養(yǎng)人皮膚鱗癌A431細(xì)胞，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況。
　　2、在最佳ALA孵育濃度1mM，最佳孵育時間點(diǎn)5h時，采用30mW/cm2功率密度的630

2、nm紅光作為光源，給予不同光劑量(2J/cm2，4J/cm2)對A431細(xì)胞進(jìn)行ALA-PDT處理，采用磷脂結(jié)合蛋白V(AnnexinV)/碘化丙錠(PI)雙染法通過流式細(xì)胞術(shù)檢測ALA-PDT后不同時間點(diǎn)(4h，12h，20h，24h)，人皮膚鱗癌A431細(xì)胞凋亡情況。
　　3、western blot法檢測各時間點(diǎn)A431細(xì)胞內(nèi)iNOS的表達(dá)情況。
　　4、Griss法檢測ALA-PDT后不同時間點(diǎn)(4h，12h，20h

3、，24h) A431細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO的釋放情況。
　　5、通過上述實(shí)驗確定最佳光照劑量及最佳的觀察時間點(diǎn)，在ALA-PDT處理的同時分別給予iNOS抑制劑1400w和外源性NO供體SNP，CCK-8法檢測各組A431細(xì)胞增殖情況，倒置相差顯微鏡及HE染色后觀察凋亡的形態(tài)學(xué)變化及細(xì)胞的嗜酸性變化，同時采用磷脂結(jié)合蛋白V(Annexin V)/碘化丙錠(PI)雙染法通過流式細(xì)胞術(shù)檢測ALA-PDT誘導(dǎo)人皮膚鱗癌A431細(xì)胞的凋亡情況

4、。
　　結(jié)果:
　　1、成功培養(yǎng)了A431細(xì)胞，觀察其正常形態(tài)并繪制了其生存曲線。
　　2、流式細(xì)胞術(shù)檢測到ALA-PDT組A431細(xì)胞凋亡率隨著時間的增加而增加，且光劑量為4J/cm2時細(xì)胞凋亡率較2J/cm2多，呈一定的時間及劑量依賴性，較其他對照組有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)。
　　3、Griss法檢測到ALA-PDT處理后NO水平隨著時間的增加而增加，且光劑量為4J/cm2時產(chǎn)生的NO量較2J/cm2

5、多，呈一定的時間及劑量依賴性，較其他對照組有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)，且western blot檢測到光劑量2J/cm2時ALA-PDT組iNOS的表達(dá)量隨時間增加而增加。
　　5、分別給予iNOS抑制劑1400w和外源性NO供體SNP后，ALA-PDT組、ALA-PDT聯(lián)合1400w組、ALA-PDT聯(lián)合SNP組及單純SNP組與單純ALA組、單純照光組、空白對照組相比細(xì)胞存活率明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，ALA-P

6、DT聯(lián)合1400w組細(xì)胞生存率較ALA-PDT組高，而ALA-PDT聯(lián)合SNP組較ALA-PDT組生存率低，單純SNP組細(xì)胞較ALA-PDT聯(lián)合SNP組高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　6、倒置相差顯微鏡下可見ALA-PDT聯(lián)合1400w組、ALA-PDT組、ALA-PDT聯(lián)合SNP組細(xì)胞及單純SNP組細(xì)胞與單純ALA組、單純635nm紅光組及空白對照組相比，細(xì)胞皺縮、變圓，ALA-PDT聯(lián)合SNP組細(xì)胞皺縮、變圓程度

7、較ALA-PDT聯(lián)合1400w組、ALA-PDT組強(qiáng)，ALA-PDT組次之，ALA-PDT聯(lián)合1400w組相對較弱。
　　7、HE染色后光鏡下可見ALA-PDT聯(lián)合1400w組、ALA-PDT組及ALA-PDT聯(lián)合SNP組細(xì)胞組、單純SNP組與單純ALA組、單純635nm紅光組及空白對照組相比，嗜酸性染色增強(qiáng)，ALA-PDT聯(lián)合SNP組細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)致密、嗜酸性染色增強(qiáng)程度較ALA-PDT聯(lián)合1400w組、ALA-PDT組、單

8、純SNP組強(qiáng)，視野下呈樹葉散落狀，ALA-PDT組次之，ALA-PDT聯(lián)合1400w組相對較弱。
　　8、流式細(xì)胞術(shù)檢測到ALA-PDT組、ALA-PDT聯(lián)合1400w組及ALA-PDT聯(lián)合SNP組細(xì)胞凋亡率與單純ALA組、單純635nm紅光組、單純1400w組及空白對照組相比明顯增高(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、ALA-PDT可以抑制人皮膚鱗癌A431細(xì)胞的增殖;小劑量的ALA-PDT主要通過凋亡方式誘導(dǎo)鱗