紫外線誘導(dǎo)人黑色素瘤A375細(xì)胞自噬與凋亡效應(yīng)的初步探討.pdf

1、黑色素瘤(Cutaneous Malignant Melanoma，CMM)，又稱惡性黑色素瘤，來源于黑素細(xì)胞，呈高侵襲性，易出現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。紫外線是造成皮膚表層細(xì)胞DNA損傷的主要的物理因素之一，也是誘發(fā)黑色素瘤的明確病因之一。自噬(Autophagy)與凋亡(Apoptosis)是細(xì)胞內(nèi)兩種程序性死亡方式。細(xì)胞自噬性降解可維持生理狀態(tài)下機(jī)體的穩(wěn)態(tài)，過度自噬引起的自噬失調(diào)與腫瘤、感染、神經(jīng)退行性變等疾病相關(guān)。凋亡是通過激活內(nèi)源性DNA內(nèi)

2、切酶而誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程。惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展通常與細(xì)胞凋亡基因調(diào)控失常而導(dǎo)致凋亡障礙有關(guān)。自噬與凋亡作為兩種調(diào)控方式共同存在于細(xì)胞內(nèi)，二者共同的調(diào)控因子使二者可以發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，從而決定細(xì)胞的命運(yùn)。MicroRNA通過降解靶基因參與自噬與凋亡的調(diào)控。因此深入研究UVB的輻射損傷機(jī)制及microRNA在其中的作用，能為預(yù)防和靶向治療黑色素瘤提供重要依據(jù)。
　　研究目的：
　　探討中波紫外線(UVB)和模擬日光紫外線對(duì)A37

3、5細(xì)胞自噬、凋亡的影響，以及自噬與凋亡相互調(diào)控來分析紫外線對(duì)黑色素瘤A375細(xì)胞的生存能力等生物學(xué)功能改變，并初步探討microRNA-664在相互調(diào)控中的作用機(jī)制。
　　研究方法：
　　用不同劑量的UVB（功率密度:165μW/cm2）照射A375細(xì)胞，在照后不同時(shí)間點(diǎn)雙熒光自噬慢病毒監(jiān)測10、30、50mJ/cm2UVB照后A375細(xì)胞自噬情況的變化;CCK-8法檢測增殖變化;流氏細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡及周期變化;qPCR檢

4、測miR-664的表達(dá);Western Blot分析自噬、凋亡、周期、DNA損傷等生物學(xué)功能標(biāo)志蛋白變化。模擬不同劑量日光照射(UVA∶UVB=95∶5，UVA功率密度為118μW/cm2)，觀察照后不同時(shí)間點(diǎn)A375細(xì)胞自噬、凋亡變化，并分析相應(yīng)的生物學(xué)功能標(biāo)志蛋白變化。
　　研究結(jié)果：
　　(1)UVB照射:
　　1)0～50mJ/cm2的UVB照射，對(duì)A375細(xì)胞自噬誘導(dǎo)的能力呈先增高后降低的拋物線趨勢，30mJ

5、/cm2最強(qiáng)。10、30mJ/cm2照射后，自噬體數(shù)量在0～6h內(nèi)逐漸增多，9h開始減少。相應(yīng)地，LC3、Beclin1在0～50mJ/cm2UVB照后表達(dá)先增加后減少，10、30mJ/cm2組蛋白表達(dá)在0～6h逐漸增加，9h表達(dá)減少;
　　2)UVB照射時(shí)，10、30mJ/cm2照后均有凋亡高峰(9h)延遲于自噬高峰出現(xiàn)(6h)，且在自噬最強(qiáng)時(shí)有凋亡標(biāo)志蛋白表達(dá)被抑制;
　　3)10、30mJ/cm2的UVB照射A375細(xì)

6、胞后，細(xì)胞增殖能力均有照后0～6h逐漸增強(qiáng)，9h開始減弱的趨勢，但兩個(gè)劑量增減幅度不同。10mJ/cm2照射后，在0～9h內(nèi)，S期細(xì)胞比例增多，對(duì)應(yīng)的CDK4的表達(dá)也呈逐漸增加，且9h達(dá)最大值。30mJ/cm2照射組，未見細(xì)胞周期的明顯改變。在照后24h后細(xì)胞均表現(xiàn)為存活。
　　(2)模擬日光紫外照射:
　　1)不同劑量(10、30、50mJ/cm2)照后均可誘導(dǎo)A375細(xì)胞產(chǎn)生自噬，10、30mJ/cm2照射，自噬體在0～

7、6h內(nèi)逐漸增多，9h開始下降，50mJ/cm2模擬日光照射后自噬體在3h即可形成，在觀察時(shí)間內(nèi)均維持較高自噬水平。與之對(duì)應(yīng)的，10、30mJ/cm2組LC3、Beclin1表達(dá)在6h才出現(xiàn)顯著增加，而50mJ/cm2組在3h已顯著增加，6～12h持續(xù)高表達(dá);
　　2)單純UVA、單純UVB及模擬日光紫外照射方式分別照射A375細(xì)胞后，三者對(duì)自噬誘導(dǎo)能力的由強(qiáng)到弱依次為:模擬照射＞單獨(dú)UVB照射＞單獨(dú)UVA照射;
　　3)30

8、mJ/cm2模擬日光紫外照射A375細(xì)胞后，凋亡高峰（照后9h）延遲于自噬高峰(照后6h)出現(xiàn)，且自噬高峰有凋亡蛋白Caspase3/9的表達(dá)降低。抑制自噬后，6h、9h凋亡蛋白Caspase3/9表達(dá)增加。
　　(3)較于黑素原代細(xì)胞，miR-664在A375細(xì)胞中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-664后，UVRAG、Beclin-1表達(dá)降低，Atg5、Atg12表達(dá)量上升，BAX及Bcl-2無明顯變化。
　　研究結(jié)論：
　　

9、1.10、30mJ/cm2的UVB照射，誘導(dǎo)A375細(xì)胞產(chǎn)生的自噬促進(jìn)細(xì)胞增殖，對(duì)細(xì)胞呈保護(hù)作用，10mJ/cm2的UVB照射，可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生S期阻滯;
　　2.UVB或模擬日光紫外照射可誘導(dǎo)A375細(xì)胞產(chǎn)生自噬，UVB是主要貢獻(xiàn)者;
　　3.紫外照射誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬可以延遲凋亡的發(fā)生，促進(jìn)細(xì)胞存活;
　　4.A375細(xì)胞中miR-664的表達(dá)低于黑色素原代細(xì)胞，miR-664可能參與紫外誘導(dǎo)A375細(xì)胞自噬與凋亡相互調(diào)