rhIL-24對A375黑色素瘤細胞體內(nèi)外抗腫瘤效應及其分子機理的研究.pdf

1、本文研究目的：為研究以hlL-24基因構(gòu)建的原核表達載體pET-21a(+)／hlL-24在大腸桿菌中表達及其部分純化、復性得到的蛋白產(chǎn)物——重組人白介素24(rhTT．-24)對A375黑色素瘤細胞體內(nèi)外的抗腫瘤效應及其分子機理。 研究方法：以原核表達載體pBV220-hlL-24為模板構(gòu)建新的pET-21a(+)／h11．-24重組原核表達載體系統(tǒng)，并在大腸桿菌中獲得高效表達，將表達產(chǎn)物純化、復性后得到初步純化的rhlL-2

2、4，經(jīng)Western-blot方法鑒定后，用rhlL-24刺激PBMC，收集細胞培養(yǎng)液上清，用ELISA方法檢測PBMC分泌的IL-6、IFN-~、TN~-／1的含量。用rhIL-24作用于體外培養(yǎng)的人A375黑色素瘤細胞，用MTT法去評價rhll．-24對A375細胞生長的影響，繪制出細胞生長曲線；通過流式細胞術(shù)(FCM)，熒光染色等檢測rhlL-24對A375細胞生長周期和凋亡的影響。用rtffL-24作用于雞胚尿囊膜(CAM)，觀

3、察其對血管新生的影響。在裸鼠真皮下建立人A375細胞黑色素瘤動物模型后，用rhlL-24治療，測量瘤體的體積及重量以檢測rhlL-24等對瘤體生長的抑制作用。用免疫組化檢測腫瘤組織中的BAX、BCL-2、CD34及VEGF的表達情況，以確認經(jīng)rhlL-24治療后腫瘤細胞生長是否受到抑制及腫瘤組織血管新生是否減少。 研究結(jié)果：經(jīng)PCP-,及酶切產(chǎn)物電泳證實所克隆的基因長度與理論值接近，經(jīng)序列測定證實所克隆的基因與GenBank報道

4、的hIL-24序列完全一致，為474bp。構(gòu)建的原核表達載體pET-21a(+)／hIL-24，經(jīng)雙酶切和PCR鑒定，原核表達載體：陶建正確。pET-21a(+)／hIL-24轉(zhuǎn)染的BL21宿主菌誘導表達后裂解菌體、提取包涵體的內(nèi)容物，再進行SDS-PAGE電泳，有一條18．5KD左右的蛋白條帶出現(xiàn)，與理論值一致。Western-blot檢測該產(chǎn)物能與IL-24抗體形成特異性條帶。含pET-21a(+)／hIL-24的宿主菌BL21經(jīng)異

5、丙基．B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導后，rhIL-24在大腸桿菌中獲高效表達。初步純化的rhlL-24能刺激PBMC增加IL-6、IFN-γ／及TNF-α的分泌，72h分泌達到高峰，與陰性對照組相比，具有顯著差異(P<0．01)。rhIL-24能顯著抑制A375細胞的生長，抑制作用具有時間依賴性和劑量依賴性；rhlL-24作用于A375細胞48h的IC50(50％抑制率的濃度)是160gg／ml。FCM檢測顯示rhlL-24可使A

6、375細胞出現(xiàn)G1期阻滯，并出現(xiàn)凋亡峰，凋亡率為27．6％。在CAM血管生成抑制實驗中，數(shù)據(jù)顯示rhlL-24、EGCG與平陽霉素均可顯著抑制血管新生。其中對2級和3級血管的抑制效果明顯，與PBS陰性對照組相比較，差異顯著。成功建立了人A375細胞黑色素瘤裸鼠移植瘤模型，rhlL-24治療組治療前6d，與PBS陰性對照組相比，腫瘤體積差異不明顯，而治療6d后差異逐漸顯著。rhlL-24治療組的抑瘤率為42．4％。腫瘤組織的免疫組化檢測顯

7、示rhlL-24治療組與PBS陰性對照組相比，BAX表達顯著上升，BCL-2的表達下降，說明腫瘤細胞生長受抑制，凋亡率上升；腫瘤細胞胞漿中VEGF的表達和瘤體組織中CD34標記的微血管密度(MVD)，與陰性對照組比較，也顯著下降，說明rhlL-24治療組腫瘤細胞分泌VEGF下降、腫瘤血管生長被明顯抑制。 研究結(jié)論： 1．構(gòu)建了pET-21a(+)/hlL-24重組原核表達載體，在大腸桿菌中能高效表達rhlL-24，并獲得

8、初步純化的rhlL-24。 2．rhlL-24具有免疫刺激作用，能刺激PBMC增加IL-6、IFN-~及TNF-(I的分泌；rhlL-24對雞胚CAM微血管新生有抑制作用。 3．rhlL-24對人A375黑色素瘤細胞的生長抑制作用具有顯著時間依賴性和劑量依賴性，作用48h的IC50是160gg／mlo 4．rhlL-24可使A375細胞出現(xiàn)G1阻滯，并出現(xiàn)凋亡峰。 5．經(jīng)rhlL-24治療的人黑色素瘤裸鼠