超高靈敏流式檢測儀的多方位改進及其在化學生物學研究中的應用.pdf

1、流式細胞術(Flow Cytometry,FCM)是一種對單個細胞或細胞大小的顆粒進行快速定量分析和分選的先進技術。然而,傳統(tǒng)的流式細胞儀難以檢測粒徑小于0.5微米或者亮度少于幾百個熒光素分子的顆粒。自然界中存在著眾多的生物納米顆粒,如細菌、病毒、線粒體、分子組裝體、生物大分子等,它們的尺寸均在納米至亞微米范圍。此外,隨著納米技術的飛速發(fā)展,納米顆粒(如納米金、量子點、磁性納米顆粒、納米乳膠微球等)被廣泛地應用于標記、運載、治療、傳感、

2、分離以及純化等生物技術領域。納米顆粒以及納米生物的單個分析可揭示因集權平均而被掩蓋的個體差異,獲得顆粒的性狀分布圖,考察個體對于整體的貢獻。因此,發(fā)展先進的單個納米顆粒分析技術,快速、靈敏地對納米顆粒的尺寸、濃度及生化特性等進行同時表征,對于化學生物學研究具有重要意義。本論文以本人碩士階段搭建的單熒光通道超高靈敏流式檢測儀(High sensitivity flowcyotmter,HSFCM)為基礎,通過多方位的儀器改進,應用于化學生

3、物學研究的不同檢測體系。
　　 本論文主要包括以下幾個方面的內容:
　　 第一章為文獻綜述。主要介紹流式細胞術的概念、歷史、新型流式細胞技術的發(fā)展以及在微生物學中的應用。在本章最后部分介紹本論文的選題思路以及研究內容。
　　 第二章為HSFCM應用于單個納米顆粒的檢測。將單熒光通道HSFCM改進為側向散射光和橙色熒光信號同時檢測的雙通道HSFCM:采用532 nm激光器作為光源且功率控制在0.75 mW,側向散射

4、光和橙色熒光信號分別由光電倍增管(PMT)和單光子計數檢測器(APD)檢測。HSFCM的熒光通道可以實現單個藻紅蛋白熒光信號的檢測,信噪比約為17。散射光通道可以明確地檢出直徑為100 nm的單個聚苯乙烯納米球,且對不同大小的聚苯乙烯納米粒子具有優(yōu)良的分辨率。使用雙通道HSFCM對210 nm熒光納米顆粒進行無標樣的絕對計數,定量檢測得到的濃度與廠家的報告濃度具有良好的相關性(R2>0.99),而且在所測濃度范圍內(1.62x105～3

5、.93×107particles／mL)檢測效率達90％。對含有不同比例的熒光納米顆粒和非熒光納米顆粒的混合物進行檢測,取得了與理論值非常一致的結果。此外,對攜載阿霉素的370 nm ZrO2納米顆粒和熒光染色的細菌E.coli ER2738的檢測表明雙通道HSFCM可應用于不同材料納米粒子的分析。
　　 第三章為HSFCM應用于致病菌與總菌數目的同時檢測。為實現致病菌與總菌數的同時檢測與定量分析,將HSFCM改進為雙熒光檢測通

6、道:采用488 nm激光器作為光源且功率控制在1.0 mW,更換二向色濾光片和帶通濾光片將檢測通道改進為綠色熒光和紅色熒光雙通道,且熒光信號分別由兩個單光子計數檢測器(APD)檢測。以致病菌E.coli O157:H7和非致病菌E.coli DH5α作為檢測模型,優(yōu)化了熒光探針的選擇及染色方案,建立了細菌的核酸染色檢測體系和致病菌的單克隆抗體-生物素-親和素級聯(lián)放大檢測體系。對抗體單染或抗體與核酸共染的致病菌E.coli O157:H7

7、以及雙染的非致病菌E.coli DH5α分別進行檢測與定量,計數結果與傳統(tǒng)的平板計數法均具有很好的一致性,檢測限約為105cells／mL。對于含有不同配比E.coli O157:H7和E.coli DH5α的細菌混合樣品的檢測也取得了與理論值非常一致的結果。將抗體與核酸共染的雙熒光法應用于天然礦泉水中致病菌的檢測,結合離心富集法可使檢測限降低到102 cells／mL。實驗結果表明HSFCM在致病菌的快速鑒定與定量分析方面具有巨大的應

8、用潛力。
　　 第四章為HSFCM應用于單細菌水平低豐度β-半乳糖苷酶的檢測。為利用熒光底物FDG實現對單個細菌中低表達β-半乳糖苷酶的檢測,將HSFCM改進為側向散射光和綠色熒光同時檢測的雙通道:采用488 nm激光器作為光源且功率控制在1.0 mW,側向散射光和綠色熒光信號分別由光電倍增管(PMT)和單光子計數檢測器(APD)檢測。以轉化了質粒pUC18的大腸桿菌E.coli JM109為檢測模型；在沒有誘導劑條件下,由于存

9、在大量阻遏蛋白而使得重組E.coliJM109表達低拷貝的β-半乳糖苷酶。利用FDG對細菌中低水平表達的β-半乳糖苷酶染色,通過優(yōu)化染色條件,在HSFCM上獲得了較好的綠色熒光信號。結合MUG定量法確定了單個重組E.coli JM109細菌在沒有誘導劑存在的情況下β-半乳糖苷酶的本底表達拷貝數在92～179之間。
　　 第五章為HSFCM應用于單細菌水平自發(fā)熒光的檢測與定量。為保證較寬的信號檢測動態(tài)范圍以及靈敏度的可調性,HSF

10、CM的側向散射光和綠色熒光檢測通道的檢測器均更換為線性范圍較寬的PMT；為了提高對弱熒光信號的檢測,將488 nm激發(fā)光源的功率提高到4.5 mW。通過與不同大小聚苯乙烯納米顆粒的信號比較以及連二亞硫酸鈉的細菌自發(fā)熒光淬滅實驗(核黃素及其衍生物FAD和FMN的可逆氧化-還原性),證實HSFCM可明確地檢測到單個細菌的自發(fā)熒光信號,而且這些熒光信號主要來源于細菌中氧化型的黃素類物質。利用三種FITC當量已知的商品化熒光納米顆粒繪制FITC

11、當量與信號強度的標準工作曲線,對8種細菌的自發(fā)熒光分別進行了定量分析。此外,通過不同生長時期的細菌自發(fā)熒光的變化證明了FAD和FMN等核黃素類物質的含量和氧化還原狀態(tài)與細菌代謝以及生長狀態(tài)密切相關。
　　 第六章為HSFCM應用于單細菌水平EGFP基因表達的快速監(jiān)測。采用側向散射光和綠色熒光雙通道的HSFCM對E.coli BL21(DE3)／pET-32a(+)-EGFP和E.coli BL21(DE3)pLysS／pET-3

12、2a(+)-EGFP兩種體系中不同調控條件下的EGFP融合蛋白的表達進行快速監(jiān)測。與耗時長且操作繁瑣的SDS-PAGE檢測法相比,HSFCM可以明顯檢測到E.coli BL21(DE3)／pET-32a(+)-EGFP體系中本底表達的EGFP融合蛋白以及較嚴謹E.coli BL21(DE3)pLysS／pET-32a(+)-EGFP體系中低IPTG誘導下低表達水平的EGFP融合蛋白。此外,HSFCM還可以對不同濃度IPTG誘導下的EGF