超高靈敏流式分析技術(shù)在病毒納米顆粒多參數(shù)定量表征中的應用.pdf

1、病毒是自然界中分布最廣、基因多樣性最強的生命形式，同時它也是許多致死性疾病的罪魁禍首。歷史上各種傳染性病毒如流感病毒、天花、埃博拉病毒的肆虐給人類帶來了巨大的災難;動物病毒和植物病毒感染造成畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)的巨額經(jīng)濟損失;一些病毒甚至被制成生化武器，對人類的生命安全和社會安定產(chǎn)生嚴重威脅。另一方面，病毒作為病原體的廣泛研究使人們對其生物遺傳信息有了詳細的了解，病毒具備良好的生物相容性和穩(wěn)定性，其尺寸微小(20-200 nm)、生長繁殖迅速、

2、容易大規(guī)模生產(chǎn)且基因改造相對容易，可以通過化學或基因工程的方法進行修飾，使其發(fā)揮特定的功能，如作為醫(yī)學診斷和治療的試劑、基因傳遞的載體及抗菌劑等。
　　病毒顆粒的物理化學性質(zhì)，如粒徑、濃度、化學組成以及功能性分子的包裹效率等，直接影響其作用效果。雖然透射電子顯微鏡(Transmission electronmicroscopy, TEM)存在操作繁瑣、耗時，價格昂貴等缺點，且難以提供具有統(tǒng)計代表性的量化信息，它依然是觀察病毒顆粒的

3、粒徑和形貌最常用的方法。傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法和半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)的方法是兩種經(jīng)典的病毒濃度測定方法，但是它們只適用于具有侵染活性并能產(chǎn)生明顯細胞破損的病毒的計數(shù)，不適用于沒有侵染活性的病毒樣顆粒的分析。發(fā)展快速、靈敏、通用的病毒顆粒表征分析方法對病毒納米技術(shù)的推廣和發(fā)展至關(guān)重要。
　　流式細胞術(shù)（Flow cytometry, FCM）是一種對懸液中單個細胞或細胞大小的顆粒進行快速定量表征的先進技術(shù)，可以實現(xiàn)細胞尺寸

4、、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、核酸以及蛋白質(zhì)等物理、化學以及遺傳性質(zhì)等多參數(shù)的同時測定。病毒個體微小，結(jié)構(gòu)簡單，攜帶的生物分子相對較少，由于檢測靈敏度的限制，傳統(tǒng)流式細胞儀難以在單顆粒水平對病毒進行測定。我們課題組于2009年研制成功具有單分子檢測能力的雙通道超高靈敏流式檢測裝置(High sensitivity flow cytometer,HSFCM)，隨后又于2012年研制成功第二代超高靈敏流式檢測裝置，在檢測性能方面較傳統(tǒng)的流式細胞儀已經(jīng)有了質(zhì)的

5、飛躍，能夠檢測到單個24 nm的二氧化硅納米顆粒和7nm的納米金顆粒的散射光信號，散射檢測靈敏度較傳統(tǒng)流式細胞儀提升了4-5個數(shù)量級，可在單顆粒水平對天然生物納米顆粒進行快速的高分辨表征，對于推動納米科技、生物醫(yī)藥的發(fā)展以及基礎生命科學研究具有重要意義。
　　本論文將利用HSFCM的超高靈敏度和多參數(shù)檢測特性，建立一種在單顆粒水平對病毒進行快速檢測分析的方法，實現(xiàn)病毒顆粒的尺寸、生化性能、濃度等性狀的多參數(shù)定量表征，為生物醫(yī)學和生

6、化分析提供一個強有力的手段。本論文主要包括以下幾個方面的內(nèi)容:
　　第一章為文獻綜述。主要介紹病毒納米顆粒的重要應用和新近發(fā)展的單個病毒納米顆粒分析技術(shù)，以及本論文的選題思路和研究內(nèi)容。
　　第二章為病毒及其混合物的單顆粒水平無標記檢測。通過提高激光功率密度和進一步降低探測區(qū)體積等策略，實現(xiàn)了對粒徑只有27 nm的輕小病毒MS2的單顆粒檢測，該檢測靈敏度能夠滿足自然界中絕大多數(shù)病毒的檢測需求。HSFCM具備卓越的散射光檢測性

7、能，基于散射光強度的差異，能夠分辨不同家族的病毒顆?；旌衔?，同時也可以區(qū)分粒徑相似而內(nèi)含物不同的病毒顆粒載體。根據(jù)Rayleigh散射定律，顆粒的散射光強度與顆粒的粒徑和折射率有關(guān)，當選用折射率與病毒顆粒相近的二氧化硅納米顆粒作為粒徑標準品時，通過HSFCM測定幾種粒徑已知的二氧化硅納米顆粒的散射光強度，繪制散射光強度與粒徑的標準工作曲線，即可獲得病毒顆粒的粒徑分布信息。HSFCM實現(xiàn)了對病毒粗提混合物的高分辨表征，同時可用于組分的快速

8、定量分析。HSFCM在一分鐘的時間內(nèi)可對成千上萬個病毒顆粒進行快速的逐一分析，分辨率可與電鏡相媲美，檢測速度更快，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計代表性更強，而且懸液分析有利于保持樣品的天然狀態(tài)。
　　第三章為病毒顆粒的散射、熒光雙參數(shù)檢測。病毒是一種很有發(fā)展前景的藥物載體，但是缺少有效的表征手段直接限制了其生物醫(yī)學應用的發(fā)展。HSFCM的散射和熒光雙參數(shù)同時檢測能力，可實現(xiàn)熒光標記的病毒納米顆粒內(nèi)部包裹的基因組和表面的蛋白質(zhì)分子的表征，得到樣品顆粒的

9、分布信息。我們通過核酸標記分析病毒基因組釋放的結(jié)果，并對其釋放過程進行動態(tài)監(jiān)控，進一步對海水等復雜體系中的病毒進行熒光標記及散射、熒光雙參數(shù)的分析，建立了一種病毒納米顆?；旌衔锏亩鄥?shù)表征方法。該方法操作簡單、檢測時間短、需要的樣品量少，為病毒納米技術(shù)的發(fā)展、納米藥物研究以及生物地球化學循環(huán)提供一種有效的表征手段。
　　第四章為病毒納米顆粒的計數(shù)及濃度定量分析。在HSFCM檢測中，由于樣品流的直徑小于激光光斑，經(jīng)過探測區(qū)的樣品顆粒

10、被逐一檢測，檢測效率接近100％?；趩晤w粒計數(shù)，我們發(fā)展了病毒納米顆粒濃度的定量分析方法，與傳統(tǒng)的空斑計數(shù)法具有良好的一致性，此方法還可以用于無侵染活性的病毒樣顆粒的定量分析，相比于空斑計數(shù)法通用性更強。此外，結(jié)合熒光染色的方法，利用HSFCM散射和熒光同時檢測的性能，實現(xiàn)了血漿中病毒的檢測和濃度定量表征，為臨床病毒檢測和監(jiān)控提供一種新的方法。HSFCM對病毒納米顆粒的定量分析方法操作簡單、檢測速度快、準確性高，通用性廣，適用于不同種