超高靈敏流式分析技術(shù)在單細(xì)胞水平細(xì)菌耐藥檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、近年抗生素濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥日趨嚴(yán)重，已對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。在多種細(xì)菌耐藥機(jī)制中，細(xì)菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是80％病原菌耐藥的主要原因，它能水解抗生素的核心結(jié)構(gòu)，使抗生素失效。臨床樣本存在耐藥菌和敏感菌并存的情況，傳統(tǒng)的檢測(cè)手段難以檢測(cè)少量耐藥菌的存在。因此，發(fā)展快速、靈敏的單細(xì)胞水平β-內(nèi)酰胺類耐藥細(xì)菌的檢測(cè)手段對(duì)于制定有效的臨床治療方案具有重要意義。此外，抗生素的存在對(duì)于耐藥菌與敏感菌的生長狀態(tài)的影響也是臨床診治需要考慮的重要因素。

2、流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是一種快速的單細(xì)胞分析技術(shù)，具有靈敏、特異、多參數(shù)同時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于含有少量目標(biāo)細(xì)胞的混合樣本的準(zhǔn)確測(cè)定。但是，由于細(xì)菌粒徑微小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)較為簡單、表達(dá)的生物分子拷貝數(shù)較少等原因，傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀因靈敏度的限制難以在細(xì)菌耐藥研究領(lǐng)域發(fā)揮積極的作用。本實(shí)驗(yàn)室結(jié)合瑞利散射和鞘流單分子熒光檢測(cè)技術(shù)，發(fā)展了超高靈敏流式檢測(cè)技術(shù)（high sensitivity flow cytometr

3、y，HSFCM），所研制的超高靈敏流式檢測(cè)裝置較傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀靈敏度提高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，已成功地應(yīng)用于細(xì)菌、線粒體等微納尺度的生化分析體系。本論文將利用HSFCM的高靈敏特性，建立單細(xì)胞水平的細(xì)菌耐藥檢測(cè)方法，為細(xì)菌耐藥研究提供先進(jìn)的檢測(cè)平臺(tái)。本論文主要由以下五個(gè)部分組成:
　　 第一章緒論主要對(duì)細(xì)菌的作用與危害，抗生素的發(fā)展歷史，抗生素的作用機(jī)制，細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生機(jī)理，細(xì)菌耐藥性的獲得與傳播，以及目前耐藥細(xì)菌的檢測(cè)方法等進(jìn)行綜

4、述，進(jìn)而提出本論文的選題思路和研究內(nèi)容。
　　 第二章針對(duì)細(xì)菌周質(zhì)空間β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。我們希望通過對(duì)細(xì)菌內(nèi)部β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)來鑒定細(xì)菌是否耐藥。由于β-內(nèi)酰胺酶位于細(xì)菌周質(zhì)空間內(nèi)，無論用β-內(nèi)酰胺酶底物小分子或是β-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體對(duì)其進(jìn)行熒光標(biāo)記都需要對(duì)細(xì)菌進(jìn)行固定、破膜處理。以E.coli JM109/pUC19為耐藥菌模型，以E.coli JM109為敏感菌模型，我們分別優(yōu)化了細(xì)菌固定、破膜的實(shí)

5、驗(yàn)條件，使得β-內(nèi)酰胺酶底物小分子和β-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體能穿越細(xì)菌外膜進(jìn)入周質(zhì)空間與β-內(nèi)酰胺酶反應(yīng)，并利用這兩種熒光標(biāo)記方法分別在HSFCM上實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平耐藥細(xì)菌的檢測(cè)。我們所建立的細(xì)菌固定、破膜方法也適用于細(xì)菌周質(zhì)空間其它蛋白的檢測(cè)。
　　 第三章的內(nèi)容是建立基于β-內(nèi)酰胺酶活性的單細(xì)胞水平細(xì)菌耐藥檢測(cè)方法。β-內(nèi)酰胺酶熒光底物L(fēng)BRL1被β-內(nèi)酰胺酶水解后，會(huì)釋放出熒光殘基，共價(jià)結(jié)合在耐藥菌內(nèi)的蛋白上，我們通過優(yōu)化β

6、-內(nèi)酰胺酶熒光底物L(fēng)BRL1的加入濃度與反應(yīng)時(shí)間，在HSFCM上實(shí)現(xiàn)了耐藥菌的單細(xì)胞水平檢測(cè)，成功地應(yīng)用于混合菌中濃度低于5％的耐藥菌的指認(rèn)。此外，我們還發(fā)展了快速鑒定β-內(nèi)酰胺酶抑制劑效用的實(shí)驗(yàn)方法，并在同樣的破膜和染色條件下對(duì)表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶的革蘭氏陽性菌進(jìn)行了檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)量的半定量分析。
　　 第四章為基于免疫熒光標(biāo)記的單細(xì)胞水平細(xì)菌耐藥檢測(cè)方法的建立。我們通過熒光標(biāo)記的單克隆抗體與核酸染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行雙染，

7、利用所建立的檢測(cè)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)耐藥菌與敏感菌混合樣品中耐藥菌相對(duì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定，即使混合樣品耐藥菌的比例低至0.1％，也能精確檢測(cè)，證明了流式檢測(cè)技術(shù)在微量耐藥菌檢測(cè)方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。此外，采用該方法對(duì)抗生素存在條件下耐藥菌和敏感菌在培養(yǎng)過程中的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，將為疾病的抗生素治療提供科學(xué)的依據(jù)。
　　 第五章為總結(jié)與展望。在這一章中，我們對(duì)基于超高靈敏流式檢測(cè)技術(shù)所建立的快速、靈敏的單細(xì)胞水平細(xì)菌耐藥檢測(cè)方法進(jìn)行了總結(jié)，