基于納米金顆粒的高靈敏適配體傳感器的構(gòu)建及其在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、真菌毒素是一類具有極強(qiáng)毒性的真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于各類食物及飼料中，嚴(yán)重危害著人類和動(dòng)物的生命安全與健康。目前，高效液相層析法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法在真菌毒素分析檢測(cè)中應(yīng)用最為廣泛，這兩種方法雖然具有很好的靈敏度和較低的最低檢出限(LOD)，但是需要昂貴的儀器設(shè)備、繁瑣的操作流程、專業(yè)的技術(shù)人員等，嚴(yán)重制約了它們?cè)谑称啡粘z測(cè)中的應(yīng)用。為了獲得便捷高效、高靈敏度、高特異性、成本低廉的真菌毒素檢測(cè)技術(shù)，科研工作者們提出了多種解決

2、方案，其中包括應(yīng)用納米粒子對(duì)能夠識(shí)別待測(cè)毒素的抗體或是適配體進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)多種檢測(cè)手段，實(shí)現(xiàn)對(duì)真菌毒素的檢測(cè)。然而現(xiàn)有的檢測(cè)方法很難滿足在保有一個(gè)較寬檢測(cè)范圍的同時(shí)，獲得一個(gè)極低的檢出限。
　　為應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，本課題設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了兩種基于納米金的適配體傳感器，通過(guò)優(yōu)化設(shè)計(jì)思路，充分發(fā)揮納米材料及核酸適配體所具備的特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)真菌毒素的快速、靈敏、低成本的檢測(cè)。
　　本課題的主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　1．基于納米金構(gòu)建用

3、于AFB1檢測(cè)的適配體傳感器
　　納米金膠體在520nm左右有一特征吸收峰。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將AFB1核酸適配體修飾于納米金表面來(lái)獲得探針。檢測(cè)時(shí)，預(yù)先將待測(cè)液與一定濃度的AFB1-BSA混合，然后將上述納米金探針加入該混合體系。若待測(cè)液中沒(méi)有AFB1，納米金表面的AFB1適配體則會(huì)與BSA上的AFB1特異性結(jié)合，由于一個(gè)BSA分子上標(biāo)記有多個(gè)AFB1，從而引發(fā)納米金聚沉現(xiàn)象，納米金在特征峰處吸收強(qiáng)度下降。反之，待測(cè)液中的游離AFB1會(huì)

4、與BSA-AFB1形成競(jìng)爭(zhēng)，抑制納米金聚沉和特征吸收峰的降低。本體系中，根據(jù)納米金的特征峰吸收與待測(cè)AFB1濃度的相關(guān)性，實(shí)現(xiàn)對(duì)未知濃度的AFB1的檢測(cè)。線性檢測(cè)范圍為10 pg mL－1至1μg mL－1，最低檢測(cè)限為4.1 pg mL－1。
　　2．基于FRET現(xiàn)象構(gòu)建高靈敏OTA適配體傳感器
　　FRET適配體傳感器包括一個(gè)未經(jīng)修飾的OTA適配體作為識(shí)別探針，OTA適配體部分互補(bǔ)鏈修飾的金納米粒子（互補(bǔ)鏈末端修飾有生物

5、素，生物素-互補(bǔ)DN A-金納米粒子）作為能量受體，和一個(gè)經(jīng)Cy3標(biāo)記的鏈霉親和素作為能量供體。該適配體傳感器用于檢測(cè)OTA時(shí)，適配體與其互補(bǔ)鏈分離，與OTA特異性結(jié)合，修飾于互補(bǔ)鏈末端的生物素暴露于鏈霉親和素，通過(guò)生物素和鏈霉親和素之間的特異結(jié)合，Cy3匯集于納米金表面從而實(shí)現(xiàn)FRET。本體系中，隨著OTA濃度的逐漸增大，Cy3的發(fā)射光強(qiáng)度隨之下降。在優(yōu)化條件下，OTA的線性檢測(cè)范圍為2.5 pg mL－1至1μg mL－1，最低檢測(cè)

6、限可達(dá)1.4 pg mL－1。
　　3．核酸適配體傳感器的選擇性和特異性評(píng)價(jià)
　　我們將常見(jiàn)的FB1、DON作為干擾毒素，另將AFB1與OTA互為干擾毒素，分別加入檢測(cè)體系，評(píng)價(jià)上述兩種適配體傳感器對(duì)于非目標(biāo)物的特異性和選擇性。結(jié)果顯示，上述兩種適配體傳感器僅對(duì)目標(biāo)物表現(xiàn)出特異性響應(yīng)，表明它們均具有良好的選擇性和特異性。
　　4．選擇小麥提取物及綠咖啡提取物作為模擬樣品，評(píng)價(jià)OTA適配體傳感器在實(shí)際應(yīng)用中的潛力

7、　　為驗(yàn)證OTA適配體傳感器是否能應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)中，我們分別提取了小麥與綠咖啡的浸取液，并向其中加入已知濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)品，然后用所開(kāi)發(fā)的適配體傳感器對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：盡管在本模擬體系中所獲得的最低檢出限稍高于實(shí)驗(yàn)室條件下所得到的最低檢出限，但仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的最大容許濃度，證實(shí)了上述兩種傳感器在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用潛力和可行性。
　　綜上所述，本課題中我們充分發(fā)揮納米金和核酸適配體的特性，開(kāi)發(fā)了兩種應(yīng)用于真菌毒素