阿曼托雙黃酮通過(guò)調(diào)控炎癥信號(hào)通路預(yù)防癲癇發(fā)生及神經(jīng)保護(hù)作用研究.pdf

1、癲癇是常見(jiàn)的腦部疾病，以慢性反復(fù)自發(fā)性發(fā)作為特征，并常伴有情感和認(rèn)知功能障礙。目前癲癇的治療仍以藥物治療為主，經(jīng)合理規(guī)范的抗癇藥物治療，有約20%~30%的患者發(fā)作仍得不到有效緩解，這類癲癇被稱為難治性癲癇。顳葉癲癇是成人最常見(jiàn)的難治性癲癇，常繼發(fā)于各種原始的腦損傷并誘導(dǎo)腦內(nèi)級(jí)聯(lián)事件發(fā)生，最終導(dǎo)致癲癇易感性增高并產(chǎn)生反復(fù)自發(fā)性癲癇發(fā)作，這一過(guò)程稱為癲癇發(fā)生（epileptogenesis）。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展癲癇發(fā)生的概念得到不斷更新，

2、越來(lái)越多的臨床和實(shí)驗(yàn)證據(jù)證實(shí)，腦內(nèi)炎癥過(guò)程是癲癇發(fā)生的一個(gè)具有決定性的病理機(jī)制，它貫穿于癲癇發(fā)生的各個(gè)階段，是其各種病理生理變化的一個(gè)共同背景，而最新的共識(shí)將癲癇發(fā)生定義為能夠產(chǎn)生自發(fā)性癲癇發(fā)作癥狀后并且伴隨腦組織生長(zhǎng)發(fā)育的一種炎癥反應(yīng)過(guò)程。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明癲癇發(fā)生是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，特別是在腦部癲癇易發(fā)區(qū)域，相關(guān)的分子結(jié)構(gòu)和功能都會(huì)出現(xiàn)病理生理學(xué)上的持續(xù)變化，導(dǎo)致腦內(nèi)新的病理環(huán)境的產(chǎn)生，最終誘發(fā)癲癇。雖然目前對(duì)于癲癇發(fā)生的預(yù)防和治療仍存在較大

3、爭(zhēng)議，并且效果有待商榷，但是癲癇發(fā)生與炎癥反應(yīng)的關(guān)系及機(jī)制仍然是臨床與基礎(chǔ)研究關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　阿曼托雙黃酮（amentoflavone，AF）是具有多種生物活性的天然多酚類化合物，其在抗炎、抗微生物、抗氧化、抗腫瘤及神經(jīng)保護(hù)等方面可以發(fā)揮重要作用。研究證實(shí)，AF能夠通過(guò)抑制眾多炎性因子而發(fā)揮抗炎作用。其在腫瘤細(xì)胞中通過(guò)抑制核因子κB（Nuclear factor kappa B，NF-κB）的活化來(lái)抑制腫瘤壞死因子-α（Tumo

4、r necrosis factor，TNF-α）誘導(dǎo)的環(huán)氧合酶-2（Cyclooxygenase，COX-2）和前列腺素（Prostaglandins，PG）E2的表達(dá)，降低由NF-κB介導(dǎo)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）生成一氧化氮（nitric oxide，NO）的能力；在潰瘍性結(jié)腸炎模型中，AF預(yù)處理能夠減輕結(jié)腸黏膜損傷，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物、谷胱甘肽（reduced g

5、lutathione，GSH）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性，顯著降低NO、TNF-α、白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）-1β、IL-6、iNOS以及COX-2的水平。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中AF通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子如IL-1β和IL-6的表達(dá)來(lái)促進(jìn)抗炎反應(yīng)；AF能夠顯著下調(diào)COX-2蛋白表達(dá)水平，抑制重要炎癥介質(zhì)PGE2的合成；此外，AF能夠通過(guò)干擾半胱氨酸蛋白酶（Cysteinylaspar

6、tate-specificprotease，Caspase）活化來(lái)阻斷細(xì)胞凋亡。因此，我們推測(cè)AF能夠通過(guò)抑制調(diào)控癲癇發(fā)生時(shí)腦內(nèi)炎癥通路中的相關(guān)因子，降低神經(jīng)元損傷預(yù)防癲癇的發(fā)生。
　　本研究以氯化鋰-匹羅卡品致癇大鼠模型為基礎(chǔ)，應(yīng)用電生理、行為學(xué)、組織學(xué)和分子生物學(xué)等手段，驗(yàn)證如下假設(shè)：AF能夠通過(guò)抑制膠質(zhì)細(xì)胞激活、下調(diào)炎癥通路中相關(guān)因子水平來(lái)調(diào)控腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，預(yù)防癲癇的發(fā)生。
　　第一部分：阿曼托雙

7、黃酮對(duì)氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠癲癇易感性和認(rèn)知功能的影響
　　目的：明確AF預(yù)處理對(duì)氯化鋰-匹羅卡品大鼠癲癇模型癲癇易感性和認(rèn)知功能的影響。
　　方法：100只SD大鼠隨機(jī)分為5組：AF預(yù)處理組（pre-AF組）、AF治療組（AF組）、丙戊酸鈉預(yù)處理組（pre-VPA組）、癲癇組（EP組）、空白對(duì)照組（Control組）。建立氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠模型，采用Racine評(píng)分評(píng)估癲癇模型的發(fā)作等級(jí)差異，腦電信號(hào)監(jiān)測(cè)各組大鼠電

8、生理變化，Morris水迷宮和IntelliCage智能行為學(xué)檢測(cè)分析系統(tǒng)評(píng)價(jià)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，客觀評(píng)價(jià)AF預(yù)處理對(duì)致癇大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)（Status epilepticus，SE）和自發(fā)性發(fā)作易感性的影響，明確AF對(duì)致癇大鼠癲癇發(fā)生的預(yù)防作用。
　　結(jié)果：pre-AF組在造模后少有癲癇發(fā)作，且發(fā)作等級(jí)明顯降低，發(fā)作時(shí)間縮短，腦電信號(hào)顯示癲癇樣波出現(xiàn)的頻率及波幅均明顯降低，行為學(xué)和腦電信號(hào)表現(xiàn)與 Control組相比無(wú)明顯差異。M

9、orris水迷宮定位航行試驗(yàn)中pre-AF組大鼠逃避潛伏期較AF組、pre-VPA組和EP組縮短（P＜0.05）；在空間探索試驗(yàn)中，pre-AF組大鼠穿臺(tái)次數(shù)比AF組、pre-VPA組和EP組顯著增多（P＜0.05）。IntelliCage行為學(xué)檢測(cè)顯示，鼻觸學(xué)習(xí)測(cè)試中，與control組相比，pre-AF組、AF組、pre-VPA組、EP組的正確訪問(wèn)（visit）次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與EP組相比，pre-A

10、F組、AF組、pre-VPA組的正確訪問(wèn)次數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中pre-AF組增加次數(shù)最明顯；同時(shí)，對(duì)鼻戳（nosepoke）正確次數(shù)的觀察中得到了結(jié)果與visit一致；在位置學(xué)習(xí)測(cè)試中，與control組相比，pre-AF組、AF組、pre-VPA組、EP組的正確訪問(wèn)次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與EP組相比，pre-AF組、AF組、pre-VPA組的正確訪問(wèn)次數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

11、（P＜0.05），其中pre-AF組增加次數(shù)最明顯；位置逆轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)測(cè)試與位置學(xué)習(xí)測(cè)試結(jié)果相一致；在強(qiáng)化學(xué)習(xí)測(cè)試中，與control組相比，pre-AF組、AF組、pre-VPA組、EP組的正確鼻戳次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與EP組相比，pre-AF組、AF組、pre-VPA組的正確鼻戳次數(shù)有明顯改善（P＜0.05），其中pre-AF組改善最明顯；強(qiáng)化逆轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)測(cè)試與強(qiáng)化學(xué)習(xí)測(cè)試結(jié)果相一致。
　　結(jié)論：AF的預(yù)防性

12、用藥可以降低癲癇大鼠發(fā)作級(jí)別、縮短發(fā)作時(shí)間、改善空間學(xué)習(xí)記憶能力的下降，降低癲癇易感性。
　　第二部分：阿曼托雙黃酮對(duì)氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響
　　目的：研究AF對(duì)氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)情況，明確其在預(yù)防癲癇發(fā)生過(guò)程中的作用及可能的機(jī)制。
　　方法：雄性SD大鼠100只，分組同第一部分。建立氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠模型，應(yīng)用Nissel染色及TUNE

13、L染色觀察癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷和凋亡情況，免疫組化和Western-Blot技術(shù)檢測(cè)大鼠海馬凋亡相關(guān)蛋白 caspase-3的分布和表達(dá)水平；同時(shí)檢測(cè)各組大鼠海馬中丙二醛（malondialdehyde，MDA）、一氧化氮（Nitric oxide，NO）、GSH水平以及過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性。
　　結(jié)果：SE后72h，和control組相比

14、，pre-AF組Nissel染色顯示大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)存活的神經(jīng)元數(shù)目無(wú)明顯差異（P＞0.05）而較EP組明顯增多（P＜0.05）；與control組相比，pre-AF組TUNEL染色顯示大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均無(wú)明顯差異（P＞0.05），較EP組明顯減少（P﹤0.05）；免疫組化顯示，與control組相比，pre-AF組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均無(wú)明顯差異（P＞0.05），

15、較EP組明顯減少（P﹤0.05）；Western Blot顯示，pre-AF組與control組caspase-3蛋白表達(dá)量無(wú)顯著差異（P＞0.05），而較其他各組均顯著降低（P＜0.01）。對(duì)各組大鼠海馬氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)顯示，與control組相比，SE后24h和36h pre-AF組的GSH水平及SOD活力均無(wú)明顯差異（P＞0.05），較EP組明顯升高（P﹤0.05）；而pre-AF組CAT、MDA和NO水平與control組相比無(wú)

16、明顯差異（P＞0.05），較EP組明顯降低（P﹤0.05）。
　　結(jié)論：AF預(yù)處理通過(guò)抑制海馬氧化應(yīng)激水平降低癲癇誘發(fā)的神經(jīng)元損傷和凋亡，預(yù)防癲癇發(fā)生。
　　第三部分：阿曼托雙黃酮對(duì)氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活和海馬炎癥反應(yīng)的影響
　　目的：研究AF對(duì)氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活和海馬氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，進(jìn)一步探討其預(yù)防癲癇發(fā)生的機(jī)制及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在癲癇發(fā)生過(guò)程中可能的作用。
　　方

17、法：雄性SD大鼠100只，分組同第一部分。建立氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型，應(yīng)用免疫組化觀察大鼠海馬中Iba-1、GFAP的分布和表達(dá)，于SE后24h、48h、72h、96h提取大鼠海馬組織，應(yīng)用Western-Blot技術(shù)檢測(cè)炎癥通路中的關(guān)鍵因子NF-κB、COX-2蛋白表達(dá)變化，ELISA法檢測(cè)下游炎性因子IL-1β、TNF-α、PGE2水平。
　　結(jié)果：免疫組化顯示，AF組、pre-VPA組及EP組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)可見(jiàn)

18、較多Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞，與control組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而pre-AF組Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加明顯減少，與control組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05）；AF組、pre-VPA組及EP組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)可見(jiàn)較多GFAP陽(yáng)性細(xì)胞，與control組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而pre-AF組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加明顯減少，與control組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05）；Western Blot顯

19、示，SE后24h、48h、72h、96h，與control組相比各組大鼠海馬COX-2和NF-κBp65蛋白水平均有不同程度升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與EP組相比，pre-AF組蛋白水平均顯著降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；除control組以外，各組COX-2和 NF-κB p65蛋白表達(dá)在時(shí)間順序上呈先高后低的變化趨勢(shì)。SE后24h、48h、72h、96h，各組大鼠海馬炎癥因子IL-1β、PGE2和TNF