新型攜氧微球改善外周神經(jīng)損傷后局部缺氧微環(huán)境的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、外周神經(jīng)系統(tǒng)將大腦、脊髓與遠(yuǎn)端器官、系統(tǒng)相聯(lián)系，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)可以有效，精確地支配機(jī)體的各項(xiàng)活動(dòng)，又被稱為周圍神經(jīng)系統(tǒng)。外周神經(jīng)損傷，尤其是神經(jīng)長(zhǎng)節(jié)段缺損的修復(fù)，長(zhǎng)久以來(lái)是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域以及臨床工作中一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。自體神經(jīng)移植一直以來(lái)被公認(rèn)為外周神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域的金標(biāo)準(zhǔn)，然而，其給供區(qū)帶來(lái)的創(chuàng)傷，自身免疫排斥反應(yīng)，供體受限，以及其本身的并發(fā)癥，往往局限了自體神經(jīng)移植的應(yīng)用。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，人工構(gòu)建神經(jīng)支架取代自體神經(jīng)移植來(lái)橋接外周

2、神經(jīng)缺損成為了目前的研究趨勢(shì)。但由于缺乏有效促進(jìn)神經(jīng)再生的刺激因素，人工支架的使用不能最大程度地發(fā)揮對(duì)神經(jīng)再生的引導(dǎo)作用。因此，構(gòu)建支架內(nèi)部有利于神經(jīng)再生的微環(huán)境具有非常重要的意義。目前，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多學(xué)者將種子細(xì)胞和神經(jīng)因子植入神經(jīng)支架內(nèi)部，以促進(jìn)神經(jīng)損傷后的再生，為神經(jīng)長(zhǎng)節(jié)段缺損的修復(fù)提供了新的思路。但是，在種子細(xì)胞植入神經(jīng)支架后早期，局部缺氧微環(huán)境可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，使植入的種子細(xì)胞不能充分發(fā)揮其活性。有研究利用PFTBA水

3、凝膠改善局部缺氧微環(huán)境，從而促進(jìn)種子細(xì)胞的存活。然而，該水凝膠無(wú)法有效的控制氧氣的釋放速率，使得其對(duì)早期缺氧微環(huán)境的改善存在局限性。因此，本研究通過(guò)制備雙層攜氧微球，在不同環(huán)境下對(duì)嗅鞘細(xì)胞的存活及活性進(jìn)行評(píng)測(cè)，隨后進(jìn)行大鼠坐骨神經(jīng)缺損神經(jīng)導(dǎo)管橋接術(shù)并植入不同材料，評(píng)價(jià)該雙層攜氧微球?qū)ι窠?jīng)再生及其功能恢復(fù)的作用。本研究分為以下三部分：
　　實(shí)驗(yàn)一、Cs-PLGA雙層攜氧微球的制備及理化性質(zhì)鑒定
　　背景：在種子細(xì)胞移植早期，由

4、于支架內(nèi)的局部氧分壓難以支持功能細(xì)胞的存活，導(dǎo)致對(duì)缺損的修復(fù)不能達(dá)到預(yù)期的效果。有研究利用PFTBA水凝膠改善早期氧分壓，并取得了一定的療效。然而以水凝膠作為載體的攜氧材料不能有效的控制氧氣的釋放，導(dǎo)致PFTBA過(guò)早的消耗殆盡。因此，如何進(jìn)一步優(yōu)化局部缺氧微環(huán)境成為了亟待解決的問(wèn)題。
　　目的：制備含不同濃度PFTBA的Cs-PLGA雙層微球，并對(duì)其生物學(xué)性能進(jìn)行檢測(cè)。
　　方法：以殼聚糖（Chitosan，Cs）與PLGA

5、作為主要原料，應(yīng)用乳化-離子交聯(lián)技術(shù)制備搭載有不同濃度（5％、10%、20%）PFBTA的Cs-PLGA雙層微球。應(yīng)用掃描電鏡及免疫熒光染色以及降解率的測(cè)定對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行鑒定；通過(guò)對(duì)搭載不同濃度PFTBA的雙層微球的釋氧率進(jìn)行測(cè)定，初步篩選出后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需要的PFTBA濃度。此外，另制備Cs單層微球、PLGA單層微球與PLGA-Cs雙層微球，填充入神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損，并每天測(cè)定局部氧分壓，以分析不同微球的釋氧特點(diǎn)。
　　

6、結(jié)果：通過(guò)掃描電鏡及免疫熒光染色觀察到Cs-PLGA雙層緩釋微球具有球形外觀，其內(nèi)部具有雙層結(jié)構(gòu)且PFTBA可充分的包埋在其中。Cs微球的平均粒徑在35.34-40.18μm，PLGA微球的平均粒徑在1.03-1.29μm之間，12周后降解率接近60%。Cs-PLGA雙層微球中的PFTBA可持續(xù)釋放至少28天。此外，搭載10%與20%PFTBA的雙層微球中的氧含量在不同時(shí)間點(diǎn)明顯高于搭載5%PFTBA的雙層微球，且其兩組之間并無(wú)明顯差異

7、。通過(guò)對(duì)局部氧分壓的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同的材料在氧氣釋放速率上有不同的特點(diǎn)。
　　結(jié)論：Cs-PLGA雙層攜氧微球擁有明顯的雙層結(jié)構(gòu)，且PFTBA可以有效的包埋在其中，同時(shí)還具備良好的平均粒徑，降解率，在28天內(nèi)持續(xù)的釋放氧氣，有效延長(zhǎng)PFTBA內(nèi)氧氣釋放的時(shí)間。此外，通過(guò)對(duì)氧分壓的測(cè)定，我們發(fā)現(xiàn)Cs-PLGA微球的釋氧特點(diǎn)更適合改善局部低氧微環(huán)境。該微球的制備為后續(xù)的體外、體內(nèi)試驗(yàn)打下了良好的基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)二、探究Cs-PLG

8、A雙層攜氧微球?qū)π崆始?xì)胞缺氧模型的保護(hù)與支持作用
　　背景：隨著神經(jīng)組織工程技術(shù)的進(jìn)步，研究者們發(fā)現(xiàn)：在損傷局部植入的嗅鞘細(xì)胞細(xì)胞可以通過(guò)大量分泌大量釋放促神經(jīng)再生的相關(guān)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為神經(jīng)的再生進(jìn)程提供有利的微環(huán)境，從而對(duì)外周神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生起到了非常重要的促進(jìn)作用。然而，植入的嗅鞘細(xì)胞最長(zhǎng)存活周期不超過(guò)8周。此外，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的嗅鞘細(xì)胞不能夠?qū)ι窠?jīng)元的存活與再生起到支持作用。近年來(lái)，大量研究表明缺氧是導(dǎo)致植入細(xì)胞死亡的最重

9、要原因之一。因此，如何通過(guò)改善移植局部缺氧微環(huán)境促進(jìn)細(xì)胞的存活，成為了目前神經(jīng)組織工程領(lǐng)域面臨的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。
　　目的：探討搭載不同濃度PFTBA的Cs-PLGA雙層微球在缺氧條件下對(duì)嗅鞘細(xì)胞的保護(hù)作用
　　方法：對(duì)嗅鞘細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)與純化后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)一制備的搭載5%、10%、20%PFTBA的Cs-PLGA雙層微球?qū)⒈緦?shí)驗(yàn)分為8組：①正常培養(yǎng)組（A組）；②正常+5%PFTBA培養(yǎng)組（B組）；③正常+10%PFTBA培養(yǎng)

10、組（C組）；④正常+20%PFTBA培養(yǎng)組（D組）；⑤缺氧培養(yǎng)組（E組）；⑥缺氧+5%PFTBA培養(yǎng)組（F組）；⑦缺氧+10%PFTBA培養(yǎng)組（G組）；⑧缺氧+20%PFTBA培養(yǎng)組（H組）。隨后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)與 PrestoBlue技術(shù)，檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡與增殖情況。通過(guò)免疫熒光以及掃描電鏡檢測(cè)各組嗅鞘細(xì)胞的形態(tài)與數(shù)目變化。通過(guò)Elisa以及RTPCR檢測(cè)不同條件下相關(guān)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（NGF、BDNF、VEGF）的表達(dá)與分泌。

11、　　結(jié)果：通過(guò)上述檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在缺氧培養(yǎng)24h后，嗅鞘細(xì)胞開始發(fā)生凋亡，細(xì)胞的存活及其活性也明顯受到影響，對(duì)相關(guān)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)與分泌也出現(xiàn)下降，而在缺氧條件下使用搭載PFBTA的Cs-PLGA雙層微球有效的抑制了細(xì)胞的凋亡，增加存活細(xì)胞的數(shù)目與形態(tài)也得到很好的改善，對(duì)相關(guān)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)與分泌也較普通缺氧培養(yǎng)有所提高。其中，搭載10%與20%PFTBA的雙層微球組的改善效果明顯優(yōu)于5%PFTBA組，而10%PFTBA組與20%組在上

12、述結(jié)果之間無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論：搭載10%與20%PFTBA的Cs-PLGA雙層攜氧微球均可有效的改善缺氧微環(huán)境，促進(jìn)嗅鞘細(xì)胞的存活與活性。由于這10%PFTBA與20%PFBTA之間無(wú)明顯差異，因此在后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中我們選擇利用10%PFTBA的Cs-PLGA雙層微球。
　　第三部分、Cs-PLGA雙層攜氧微球-OECs復(fù)合系統(tǒng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)損傷的有效性研究
　　背景：利用神經(jīng)導(dǎo)管橋接長(zhǎng)節(jié)段缺損時(shí)，在神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)植入

13、種子細(xì)胞，構(gòu)建功能性導(dǎo)管可為神經(jīng)再生提供物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)的支持，有效的促進(jìn)神經(jīng)再生與功能恢復(fù)。但在移植早期，導(dǎo)管內(nèi)局部缺氧微環(huán)境不足以支持種子細(xì)胞的存活，充分發(fā)揮其活性，導(dǎo)致修復(fù)不能達(dá)到預(yù)期的效果。有研究利用PFTBA水凝膠聯(lián)合嗅鞘細(xì)胞構(gòu)建復(fù)合修復(fù)系統(tǒng)植入神經(jīng)導(dǎo)管成功的橋接了大鼠坐骨神經(jīng)15mm缺損。然而由于水凝膠載體具有強(qiáng)大突釋特性，其中的PFTBA在移植術(shù)后短期迅速在局部釋放，使局部氧分壓不足以在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)一直維持在相對(duì)較高的水平。因此，如

14、何進(jìn)一步優(yōu)化PFTBA這一氧氣載體的應(yīng)用，使其更有效地提高局部氧分壓，并在相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間維持其在適當(dāng)?shù)乃?，成為了本研究的焦點(diǎn)。
　　目的：探討搭載PFTBA的Cs-PLGA的雙層微球與嗅鞘細(xì)胞復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管橋接大鼠坐骨神經(jīng)缺損后，促進(jìn)神經(jīng)再生以及功能恢復(fù)的效能。
　　方法：根據(jù)動(dòng)物模型的不同，將實(shí)驗(yàn)分為5組：自體神經(jīng)移植組（A組）、空導(dǎo)管移植組（CF組）、搭載10%PFTBA的Cs-PLGA雙層微球移植組（CFM組）、嗅鞘細(xì)

15、胞移植組（CFO組）、Cs-PLGA雙層微球-嗅鞘細(xì)胞復(fù)合移植組（CFOM組）。根據(jù)組別將不同干預(yù)因素填充入神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)，修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)15mm缺損。通過(guò)形態(tài)計(jì)量學(xué)分析、免疫熒光染色評(píng)估神經(jīng)再生的情況；通過(guò)對(duì)形態(tài)學(xué)分析、熒光金逆行示蹤、神經(jīng)電生理的檢測(cè)以及術(shù)后靶肌肉的恢復(fù)情況以評(píng)估神經(jīng)功能恢復(fù)的情況。
　　結(jié)果：通過(guò)上述檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)Cs-PLGA雙層攜氧微球與嗅鞘細(xì)胞的單獨(dú)植入均可有效地促進(jìn)了神經(jīng)的再生及功能的恢復(fù)，但修復(fù)效果仍不