兩種神經(jīng)缺損局部再生微環(huán)境模式的構(gòu)建及其修復(fù)效果的實驗研究.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷（Peripheralnerveinjury，PNI）通常由事故傷、暴力傷及醫(yī)源性損傷導(dǎo)致，是臨床上最為常見的創(chuàng)傷類型之一。神經(jīng)缺損（Nervedefect），尤其是長節(jié)段的神經(jīng)缺損（>5cm）是周圍神經(jīng)損傷中創(chuàng)傷最嚴重、修復(fù)最困難、致殘率最高的類型。臨床上長節(jié)段神經(jīng)缺損的標(biāo)準(zhǔn)治療模式是借助顯微外科技術(shù)移植自體神經(jīng)（通常是皮神經(jīng)）橋接缺損斷端，通過對端吻合的方式進行修復(fù)。然而，自體神經(jīng)移植術(shù)的應(yīng)用通常受到諸多因素的制約，例如

2、：供區(qū)所能獲取的自體神經(jīng)移植物的數(shù)量、長度及直徑有限；二次手術(shù)給患者自體神經(jīng)供區(qū)造成的繼發(fā)性損傷等。此外，目前的顯微外科技術(shù)已經(jīng)非常精細，難于產(chǎn)生新的突破；但是神經(jīng)修復(fù)效果仍不滿意，有待進一步的改善。近年來，組織工程（Tissueengineering，TE）與再生醫(yī)學(xué)（Regenerativemedicine，RM）的交叉結(jié)合促進了神經(jīng)組織工程（Neuraltissueengineering，NTE）的發(fā)展，為長節(jié)段神經(jīng)缺損的修復(fù)開辟

3、了新的途徑。
　　周圍神經(jīng)損傷后，神經(jīng)細胞內(nèi)在的再生能力被激活，并在損傷后早期即開始再生。自體神經(jīng)移植物橋接神經(jīng)缺損的優(yōu)勢在于它能為再生軸突延長和通過缺損區(qū)域提供良好的再生微環(huán)境（Regenerativemicroenvironment，RME），即：由細胞外基質(zhì)構(gòu)成的基底膜微管結(jié)構(gòu)，為軸突的再生提供物理和分子引導(dǎo)信號；雪旺細胞（Schwanncells，SCs）及其分泌的多種神經(jīng)營養(yǎng)因子（Neurotrophicfactors，

4、NTFs）、細胞粘附分子（Celladhesionmolecules，CAMs）和基底膜組份等，為軸突再生提供物質(zhì)和營養(yǎng)支持。此外，神經(jīng)再生需要豐富的血管系統(tǒng)提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)和氧，以及運輸代謝產(chǎn)物；適宜的電刺激環(huán)境亦有利于激活受損神經(jīng)細胞，促進軸突生長錐的生發(fā)和延展等。因此，在神經(jīng)修復(fù)再生過程中，再生微環(huán)境的構(gòu)建和重新形成扮演著關(guān)鍵角色。
　　目前對于長節(jié)段神經(jīng)缺損修復(fù)的研究主要集中在應(yīng)用組織工程神經(jīng)支架橋接缺損，并在此基礎(chǔ)上結(jié)

5、合其他手段如復(fù)合細胞或引入神經(jīng)營養(yǎng)因子構(gòu)建再生微環(huán)境。然而，此類研究大多基于結(jié)構(gòu)相對單一的神經(jīng)支架，基于高度仿真性能的神經(jīng)支架構(gòu)建再生微環(huán)境的研究尚少見于報道。本課題立足于具有軸向平行排列的多微管結(jié)構(gòu)的高仿真神經(jīng)支架，從不同角度探索有利于神經(jīng)再生的微環(huán)境的構(gòu)建并分別應(yīng)用于動物神經(jīng)缺損模型的修復(fù)以觀察其有效性，構(gòu)建出兩種不同的再生微環(huán)境模式，即：⑴、通過移植自體大網(wǎng)膜包裹神經(jīng)支架，提高神經(jīng)支架的血管化程度，為神經(jīng)再生提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)和氧

6、的供給及促進代謝產(chǎn)物的運輸；⑵、在神經(jīng)支架內(nèi)部種植雪旺細胞，模擬天然神經(jīng)內(nèi)部的再生微環(huán)境，為神經(jīng)再生提供必要的神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)支持，提高功能恢復(fù)水平。上述研究極大的豐富了神經(jīng)組織工程學(xué)的研究理論，為神經(jīng)缺損的修復(fù)增加了新的有效手段。具體研究內(nèi)容如下：
　　第一部分：多微管結(jié)構(gòu)高仿真神經(jīng)支架的制備及相關(guān)性能參數(shù)檢測
　　背景:組織工程神經(jīng)支架有望解決長節(jié)段神經(jīng)缺損修復(fù)所面臨的一系列難題。然而，目前的神經(jīng)支架多為相對單一的中空結(jié)構(gòu)，

7、與自體神經(jīng)內(nèi)部結(jié)構(gòu)差異較大，神經(jīng)修復(fù)效果欠佳。近年來，在神經(jīng)支架內(nèi)部模擬自體神經(jīng)所特有的基底膜微管結(jié)構(gòu)引導(dǎo)神經(jīng)再生受到了廣泛的關(guān)注。本課題組前期制備了具有軸向排列的多微管結(jié)構(gòu)的CCH神經(jīng)支架，該支架顯示了良好的再生軸突的物理引導(dǎo)作用。
　　目的:制備CCH神經(jīng)支架，為下一步實驗研究提供結(jié)構(gòu)載體。
　　方法:以膠原和殼聚糖為原料，按照課題組前期探索的“梯度冷凍結(jié)晶-真空凍干法”制備具有三維立體結(jié)構(gòu)的CCH神經(jīng)支架，并以京尼平為

8、交聯(lián)劑進行交聯(lián)。采用掃描電鏡觀察支架微觀結(jié)構(gòu)，測量其孔隙率、降解率和吸水膨脹率等指標(biāo)評價支架性能。
　　結(jié)果:掃描電鏡觀察顯示，本研究制備的神經(jīng)支架具有軸向平行排列的多微管結(jié)構(gòu)，橫截面上呈蜂窩狀的多孔結(jié)構(gòu)，高度仿生于自體神經(jīng)的基底膜微管結(jié)構(gòu)。對其相關(guān)性能指標(biāo)檢測顯示，該支架具有較高的孔隙率（91.5％）；交聯(lián)后支架的降解率和吸水膨脹率相對于單純未交聯(lián)支架明顯降低。
　　結(jié)論:本研究成功制備了CCH神經(jīng)支架。該支架原料來源廣泛

9、，制備方法易于操作，具有良好的可重復(fù)性和穩(wěn)定的性能指標(biāo)。CCH神經(jīng)支架高度仿生于自體神經(jīng)的基底膜微管結(jié)構(gòu)，在引導(dǎo)軸突再生過程中具有顯著的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢。
　　第二部分：大網(wǎng)膜包裹CCH神經(jīng)支架促進神經(jīng)缺損修復(fù)的有效性研究
　　背景:在神經(jīng)支架橋接神經(jīng)缺損修復(fù)再生的研究中，血管化程度不足常常制約神經(jīng)組織的存活和再生，進而影響神經(jīng)支架移植的成功率和臨床實際應(yīng)用。大網(wǎng)膜（Greatomentum）具有高效的促血管化能力，能夠促進組織器官

10、的再生和成熟。目前，聯(lián)合運用組織工程神經(jīng)支架和大網(wǎng)膜修復(fù)長節(jié)段神經(jīng)缺損、改善軸突再生和功能恢復(fù)的研究尚少見于報道。
　　目的:探討移植自體大網(wǎng)膜結(jié)合CCH神經(jīng)支架修復(fù)長節(jié)段神經(jīng)缺損的有效性。
　　方法:應(yīng)用CCH神經(jīng)支架橋接15mm長的大鼠坐骨神經(jīng)缺損，移植自體大網(wǎng)膜包裹神經(jīng)支架橋接區(qū)域。采用再生神經(jīng)形態(tài)學(xué)分析和熒光金（Fluorogold，F(xiàn)G）逆行示蹤標(biāo)記評價神經(jīng)再生情況；采用坐骨神經(jīng)功能指數(shù)分析（Sciaticfunc

11、tionindex，SFI）、電生理學(xué)評價以及靶肌肉形態(tài)學(xué)分析評價運動功能恢復(fù)情況。
　　結(jié)果:大網(wǎng)膜包裹CCH神經(jīng)支架組神經(jīng)再生水平和運動功能恢復(fù)程度顯著優(yōu)于單純CCH神經(jīng)支架組，與自體神經(jīng)組實驗結(jié)果間無顯著性差異。初步進行機制研究發(fā)現(xiàn)，與單純支架組相比，大網(wǎng)膜包裹CCH支架組在修復(fù)早期（術(shù)后2-4w），其血管內(nèi)皮生長因子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、神經(jīng)生長因子（Nervegro

12、wthfactor，NGF）和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF）的蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。
　　結(jié)論：大網(wǎng)膜包裹神經(jīng)支架橋接神經(jīng)缺損能夠有效的提高神經(jīng)再生水平和運動功能恢復(fù)程度，其促神經(jīng)再生效能可能與大網(wǎng)膜分泌的多種生長因子相關(guān)。
　　第三部分：CCH神經(jīng)支架復(fù)合雪旺細胞促進神經(jīng)缺損修復(fù)的有效性研究
　　背景：自體神經(jīng)橋接神經(jīng)缺損的優(yōu)勢在于其具有

13、由細胞外基質(zhì)構(gòu)成的基底膜微管結(jié)構(gòu)，為神經(jīng)再生提供物理和分子引導(dǎo)信號；內(nèi)部的雪旺細胞及其分泌的多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，為軸突再生提供物質(zhì)和營養(yǎng)支持。CCH神經(jīng)支架模擬了自體神經(jīng)內(nèi)部的軸向多微管結(jié)構(gòu)，在其三維立體結(jié)構(gòu)內(nèi)植入雪旺細胞后有望進一步完善其內(nèi)部的再生微環(huán)境，促進受損神經(jīng)修復(fù)再生。
　　目的：在CCH支架內(nèi)部植入雪旺細胞，并將此組合應(yīng)用于神經(jīng)缺損修復(fù)檢驗其效能。
　　方法：將雪旺細胞植入CCH神經(jīng)支架進行體外培養(yǎng)，在不同時間觀察

14、點（3d，1w，2w）利用掃描電鏡觀察其粘附、遷移和增殖情況；將植入雪旺細胞的CCH支架用于橋接15mm大鼠坐骨神經(jīng)缺損，藉此檢驗該組合促神經(jīng)缺損修復(fù)的效能。神經(jīng)再生和功能恢復(fù)情況分別以再生神經(jīng)形態(tài)學(xué)分析、熒光金逆行示蹤標(biāo)記和坐骨神經(jīng)功能指數(shù)分析、電生理學(xué)評價以及靶肌肉形態(tài)學(xué)分析進行評價。
　　結(jié)果：體外培養(yǎng)3d后，雪旺細胞粘附并遷移到支架內(nèi)部；2w后細胞數(shù)量較前期明顯增多。此外，雪旺細胞在支架內(nèi)沿微管方向延展并形成細胞-細胞間連