桔梗聯(lián)用順鉑對(duì)裸鼠原位肺癌的協(xié)同作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　探討肺經(jīng)引經(jīng)藥桔梗對(duì)順鉑抗肺癌作用的協(xié)同增效作用，并從藥效學(xué)、藥物動(dòng)力學(xué)和分子生物學(xué)等方法初步探討其作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.桔梗對(duì)順鉑抗裸鼠A549原位移植瘤的影響
　　通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，構(gòu)建帶有熒光素酶的人非小細(xì)胞肺癌A549-luc細(xì)胞。將A549-luc細(xì)胞通過(guò)胸腔穿刺方法接種至裸鼠右肺，建立裸鼠原位肺腺癌移植瘤動(dòng)物模型，將造模組隨機(jī)分為為:模型組;順鉑(DDP)組;DDP+桔梗(PG)低劑

2、量組;DDP+PG中劑量組;DDP+PG高劑量組。給藥周期30天，觀察裸鼠的各項(xiàng)生命體征，小動(dòng)物活體成像技術(shù)觀察記錄各組裸鼠的瘤體生長(zhǎng)變化及轉(zhuǎn)移情況，最后一次給藥24h后取材，稱(chēng)量裸鼠體重及臟器重量，并計(jì)算臟器指數(shù)。采用HE染色法觀察藥物治療后裸鼠肺臟、腎臟及肝臟的病理學(xué)變化特點(diǎn);提取腫瘤組織蛋白后，采Western bolt法觀察裸鼠移植瘤組織Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-9的蛋白表達(dá)的變化情況。
　　2.桔梗對(duì)順

3、鉑在裸鼠體內(nèi)趨向性分布影響
　　利用高效液相色譜法檢測(cè)桔梗對(duì)順鉑在裸鼠體內(nèi)的趨向性分布情況，評(píng)價(jià)桔梗對(duì)順鉑是否具有引經(jīng)作用，并利用RT-qPCR方法檢測(cè)裸鼠肺組織中AQP1、AQP5、P-gp的mRNA表達(dá)情況，初步探討桔梗聯(lián)用順鉑的引經(jīng)作用及可能機(jī)制。
　　3.桔梗對(duì)順鉑抗A549細(xì)胞增殖的影響
　　采用MTT法來(lái)檢測(cè)不同濃度桔梗組(PG:1、2.5、5、6、8、10 mg/mL)、順鉑組(DDP:0.5、1、2、5

4、，10 mg/L)及兩藥不同給藥順序聯(lián)合組作用于A549細(xì)胞后，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用，并計(jì)算出聯(lián)合用藥指數(shù)。流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytomery，F(xiàn)CM)檢測(cè)PG(4 mg/mL)組、DDP(5 mg/L)及PG+DDP聯(lián)合組處理A549細(xì)胞24h后對(duì)細(xì)胞的周期阻滯、凋亡率的影響。Western bolt法檢測(cè)A549細(xì)胞經(jīng)PG，DDP作用單獨(dú)或聯(lián)合給藥及經(jīng)抑制劑LY29400作用后Akt、P-Akt、Bcl-2、Bax、Caspa

5、se-9的蛋白表達(dá)的變化情況。
　　結(jié)果:
　　1.桔梗對(duì)順鉑抗裸鼠A549原位移植瘤的影響
　　(1).動(dòng)物一般生命體征:接種后，活體成像觀察，移植瘤成瘤率100％。裸鼠接種后至給藥前:各組小鼠的飲食、活動(dòng)、生長(zhǎng)和精神狀態(tài)都正常;化療初期（給藥第5天至15天）模型組裸鼠體重增加，各給藥組裸鼠體重開(kāi)始下降，各給藥組裸鼠的皮膚顏色變淺;化療中期（給藥第16天至25天）:與模型組相比，給藥各組裸鼠活動(dòng)減少，皮下脂肪減少，皮

6、膚失去光澤變粗糙;化療后期（給藥第26天至35天）:模型組裸鼠進(jìn)食下降，活動(dòng)量減少，呼吸頻率加快，體重開(kāi)始減輕，連續(xù)出現(xiàn)死亡。順鉑組老鼠精神萎靡不振，與順鉑單用組相比，聯(lián)用桔梗各組老鼠活動(dòng)量多，行動(dòng)較為靈活。實(shí)驗(yàn)周期35天內(nèi)，模型組DDP組;DDP+ PG低劑量組;DDP+PG中劑量組;DDP+PG高劑量組的死亡率分別為:50％、8.3％、8.3％;0％、8.3％。
　　(2).桔梗對(duì)順鉑抑瘤率的影響:與模型組相比較，各給藥組瘤指

7、數(shù)均有顯著下降，DDP及DDP聯(lián)用桔梗低、中、高劑量的抑瘤率分別為25.44％、42.28％、55.09％、35.82％(P＜0.05)。與DDP單用組相比較，聯(lián)合桔梗低、中、高劑量組抑瘤率分別增強(qiáng)了19.18％、39.76％、13.92％，中劑量桔梗組差異最顯著(P＜0.05)。與模型組相比較，各給藥組明顯降低了裸鼠的肝臟指數(shù)、脾指數(shù)(P＜0.05)。
　　(3).桔梗聯(lián)用順鉑對(duì)腫瘤凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響:與模型組相比，DDP組

8、及DDP聯(lián)用桔梗各組均顯著上調(diào)了裸鼠移植瘤中Bax蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，但DDP單用組還顯著上調(diào)了Akt、Bcl-2的表達(dá)(P＜0.05);與DDP組相比，各聯(lián)合用藥組的Bax蛋白表達(dá)有上升趨勢(shì)，DDP+PG高劑量組顯著上調(diào)(P＜0.05)。另外與DDP組的C-caspase-9相比，DDP聯(lián)用PG低、中、高劑量組均上調(diào)其表達(dá)，分別上調(diào)了18％、94％、115％。
　　2.桔梗對(duì)順鉑在裸鼠體內(nèi)趨向性分布影響
　　(1)

9、.桔梗對(duì)順鉑組織分布影響:桔梗顯著增加了順鉑在肺臟、脾臟的藥物濃度，低、中、高劑量增加幅度分別為31.1％、43.0％、33.0％;51.0％、30.0％、18.9％。與此同時(shí)，聯(lián)用桔梗顯著降低了順鉑在肝臟、心臟、小腸中的藥物濃度，低中高劑量降低幅度分別為15.7％、38.3％、56.1％;45.7％、52.3％、37.8％;43.0％、45.6％、62.3％。與其他臟器相比較而言，血漿和腎臟聯(lián)用桔梗前后，變化較小。
　　(2).

10、RT-qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，各給藥組顯著降低腫瘤組織中AQP1的mRNA表達(dá)(P＜0.05)。與對(duì)照組相比較，順鉑對(duì)P-gp的mRNA表達(dá)無(wú)顯著影響，然而，聯(lián)用桔梗后顯著降低P-gp的基因表達(dá)(P＜0.01);與DDP組比較，聯(lián)用桔梗低、中、高劑量對(duì)P-gp基因表達(dá)分別降低32.62％、28.88％、65.78％。
　　3.桔梗對(duì)順鉑抗A549細(xì)胞增殖作用的影響
　　(1).桔梗、順鉑對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響:桔

11、梗對(duì)A549細(xì)胞增殖具有抑制作用，桔梗作用24h、48h、78h的IC50值分別為:6.22±0.56、5.34±0.23、4.61±0.97 mg/mL。DDP可濃度-時(shí)間依賴(lài)性的抑制A549細(xì)胞增殖，給藥24h、48h、78h的IC50值分別為:7.22±0.89、2.48±1.01、0.78±0.78mg/L;桔梗聯(lián)用順鉑抗A549增殖效果與二者給藥順序有關(guān):同時(shí)給予PG(4 mg/mL)和DDP(5 mg/L)培養(yǎng)A549細(xì)胞4

12、8h后，抑制率最高。二者聯(lián)合用藥指數(shù)Q值在0.85-1.15之間，提示二者聯(lián)用藥效疊加。
　　(2).流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)桔梗聯(lián)用順鉑對(duì)A549細(xì)胞周期阻滯:與control組比較，PG(4 mg/mL)組，G0/G1期比列明顯上升，S期比例下降，表現(xiàn)為G0/G1期阻滯(P＜0.01);與control組比較，順鉑(5mg/L)組，S期比例上升，表現(xiàn)為S期的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)阻滯(P＜0.01);而PG和DDP聯(lián)合作用于人肺癌A549細(xì)胞后，與D

13、DP單用組比較，G0/G1期比例增高了48.01％(P＜0.01)，及S期細(xì)胞比例下降19.83％(P＜0.01)。
　　(3).流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)桔梗聯(lián)用順鉑對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響:PG(4mg/mL)、DDP(5 mg/L)組及二者聯(lián)合用藥組A549細(xì)胞的凋亡率分別為18.83％，27.77％，53.00％，均高于control組的4.40％(P＜0.01)。聯(lián)合用藥組的凋亡率(53.00±5.20)分別高于PG組(18.83±

14、6.12)及DDP(27.77±1.77)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，與順鉑單用組相比較，聯(lián)用桔梗顯著性的增加了A549細(xì)胞的晚期凋亡率(P＜0.01)。
　　(4).Western blotting分析結(jié)果顯示:在分別單獨(dú)用DDP、PG及其聯(lián)合使用作用于A549的基礎(chǔ)上加用P13K特異性抑制劑LY294002，觀察PG+DDP與LY294002+DDP的作用情況。與空白對(duì)照組相比:PG組及DDP組組顯著下調(diào)Bcl-2蛋

15、白表達(dá)(P＜0.05)，DDP+PG顯著下調(diào)Bcl-2與P-Akt的表達(dá)(P＜0.05)。與DDP單獨(dú)用藥組比較，DDP聯(lián)用PG和LY294002后P-Akt蛋白及Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)。LY294002+DDP組與PG+DDP組相比較，各組蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異。
　　結(jié)論:
　　桔?？稍鰪?qiáng)順鉑抗裸鼠A549原位移植瘤生長(zhǎng)，改善裸鼠生存質(zhì)量，延長(zhǎng)裸鼠生存率，其相關(guān)作用機(jī)制可能與其影響順鉑在裸鼠體內(nèi)分布、改變