BFA協(xié)同增強(qiáng)順鉑抗腫瘤的作用及分子機(jī)制.pdf

1、目的：探究BFA與順鉑體外抗人肺癌和人卵巢癌的協(xié)同作用及分子機(jī)制。
　　方法：將人肺癌細(xì)胞（GLC-82）和人卵巢癌細(xì)胞（SK-OV-3）分別分為對照組、BFA組、CDDP組、BFA+CDDP組。對各組進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：（1）MTT法測定BFA和CDDP單獨(dú)及聯(lián)合處理對人肺癌細(xì)胞株GLC-82和人卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3生長抑制率；（2）藥物聯(lián)合作用指數(shù)（CI）、藥物劑量降低指數(shù)（DRI）和等效圖解法分析兩藥物之間藥效學(xué)的相互作用；

2、（3）倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；（4） DAPI染色，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核變化；（5）Annexin V-FITC/PI雙染，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；（6）JC-1染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位變化；（7）實(shí)時熒光定量 PCR（q-RT-PCR）和蛋白免疫印跡（Western blot）檢測線粒體凋亡通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子GRP78、GRP94、CHOP及PERK-ATF4通路、IRE1α-XBP1通路、ATF6通路相關(guān)基因

3、及Caspase3的表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）MTT結(jié)果表明，BFA和CDDP處理GLC-82細(xì)胞和SK-OV-3細(xì)胞24 h時，對細(xì)胞的生長均具有顯著的抑制作用，且呈劑量性依賴，GLC-82細(xì)胞的IC50分別為100 ng/ml和4μg/ml，SK-OV-3細(xì)胞的IC50分別為450 ng/ml和9μg/ml；且BFA和CDDP聯(lián)合處理各濃度組合CI值絕大多數(shù)小于1，DRI值均大于1，其劑量比例點(diǎn)絕大多數(shù)位于等效線下方。
　

4、?。?）細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：藥物處理24 h后，BFA處理組細(xì)胞皺縮、變圓，CDDP處理組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化但有少量凋亡細(xì)胞，BFA+CDDP處理組較單獨(dú)用藥組細(xì)胞皺縮、變圓加劇且凋亡細(xì)胞增多；藥物處理48 h后較24 h細(xì)胞形態(tài)的異常變化進(jìn)一步加劇。
　?。?）DAPI染色觀察：藥物處理24 h后，對照組細(xì)胞核完整染色均勻，BFA處理組和CDDP處理組細(xì)胞核固縮且呈致密濃染，BFA+CDDP處理組與單獨(dú)用藥組無明顯差異；藥物處理48

5、 h后，較24 h細(xì)胞形態(tài)變化進(jìn)一步加劇，但BFA+CDDP處理組呈致密濃染細(xì)胞核數(shù)量及核裂解碎片顯著增多。
　?。?）流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡： BFA+CDDP處理 GLC-82細(xì)胞凋亡率為（14.1±2.3）％，顯著高于BFA處理組（P<0.01）、CDDP處理組（P<0.01）及對照組（P<0.01）；BFA+CDDP處理 SK-OV-3細(xì)胞凋亡率為（17.0±1.3）%，顯著高于BFA處理組（P<0.01）、CDDP處理組（P

6、<0.01）及對照組（P<0.01）。
　?。?）流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位： BFA+CDDP處理GLC-82細(xì)胞線粒體膜電位下降率為（28.3±0.7）%，顯著高于BFA處理組（P<0.01）、CDDP處理組（P<0.01）及對照組（P<0.01）；BFA+CDDP處理SK-OV-3細(xì)胞線粒體膜電位下降率為（13.9±1.7）%，顯著高于BFA處理組（P<0.01）、CDDP處理組（P<0.01）及對照組（P<0.01）。

7、r>　　（6）線粒體凋亡通路相關(guān)基因的表達(dá)：藥物處理24 h后，與對照組和單獨(dú)處理組相比，BFA+CDDP處理組BCL2、 Bax和Cyt C的表達(dá)均增加；而48 h后，BCL2表達(dá)顯著降低，而Bax和Cyt C的表達(dá)仍維持較高的水平。
　?。?）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路相關(guān)基因的表達(dá)：藥物處理24 h后，與對照組和單獨(dú)處理組相比，BFA+ CDDP處理 GLC-82細(xì)胞和SK-OV-3細(xì)胞 ERS伴侶蛋白GRP78、GRP94以及各通

8、路的相關(guān)蛋白PERK、ATF4、IRE1α、XBP1、ATF6、CHOP的表達(dá)均上調(diào)；而48 h后，GRP78、GRP94、PERK、ATF4、IRE1α、XBP1、ATF6均呈不同程度的下調(diào)，但轉(zhuǎn)錄因子CHOP的表達(dá)仍維持較高的水平。
　　（8）Caspase3的表達(dá)：藥物處理24 h后，與對照組和單獨(dú)處理組相比，BFA+CDDP處理組Caspase3的表達(dá)上調(diào)，且其剪切激活增加；藥物處理48 h后，Caspase3剪切激活進(jìn)一