順鉑誘導(dǎo)HBV再激活的分子機(jī)制研究.pdf

1、據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全世界目前約有20億人曾感染過乙肝病毒，其中約有4億成為乙肝表面抗原陽性的慢性攜帶者，而其中的75％的慢性攜帶者是中國人；中國每年因乙肝病毒感染致死的近50萬人，居全球首位。在我國，乙型肝炎病毒感染是誘發(fā)慢性肝炎，肝硬化和肝癌的重要危險(xiǎn)因子。據(jù)統(tǒng)計(jì)，HBV再激活現(xiàn)象在無癥狀攜帶者和慢性乙肝患者中極少發(fā)生，但如果接受免疫抑制劑或或化療藥物治療時(shí)，會(huì)有一定幾率活化處于靜息狀態(tài)或是低復(fù)制狀態(tài)的乙肝病毒.大量瞬時(shí)活化的乙肝病

2、毒會(huì)誘發(fā)患者急性肝炎、急性肝衰竭甚至爆發(fā)性肝衰竭，使化療中斷，耽誤腫瘤患者的正常治療和預(yù)后，嚴(yán)重時(shí)可能危及患者生命。2011年，惡性腫瘤上升為人類死亡病因的第3位，其發(fā)病率和致死人數(shù)逐年上升。2011年，臨床統(tǒng)計(jì)HBV再激活的發(fā)病率為14%-66%， HBV再激活已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅中國人健康的重要公共衛(wèi)生問題。
　　順鉑等化療藥物可以誘導(dǎo) HBV再激活的現(xiàn)象已被國內(nèi)外多項(xiàng)臨床試驗(yàn)證實(shí)，但是其誘導(dǎo)乙肝病毒復(fù)制再激活的分子機(jī)制至今尚不清

3、楚。目前解釋該現(xiàn)象的機(jī)制有兩種：第一種，化療藥物如順鉑具有很強(qiáng)的免疫抑制能力，通過抑制機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使乙肝病毒免疫逃逸，乙肝病毒大量復(fù)制誘發(fā)HBV再激活。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)同這一機(jī)制。第二種，化療藥物順鉑可以直接促進(jìn)乙肝病毒復(fù)制。目前國內(nèi)外關(guān)于順鉑直接促進(jìn)HBV再激活以及相關(guān)分子機(jī)制的研究報(bào)道還是空白，本課題設(shè)計(jì)就是針對這一空白，研究探討順鉑直接促進(jìn)HBV復(fù)制的相關(guān)的分子通路。
　　我們首先在體外成功構(gòu)建了環(huán)化自連的 HBV DNA(

4、circμlarized HBV DNA)并證實(shí)：無論在體內(nèi)還是體外，環(huán)化的HBV DNA的感染效率和復(fù)制水平均明顯優(yōu)于線性的HBV DNA(P<0.05)。使用環(huán)化的HBV DNA構(gòu)建的HBV水動(dòng)力小鼠模型，并使用回交傳代法提高已有的C57 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的遺傳穩(wěn)定性，為下一步的實(shí)驗(yàn)研究提供 HBV高效復(fù)制的動(dòng)物模型。其次選用乙肝病毒穩(wěn)定表達(dá)的C57 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型和前期構(gòu)建的HBV水動(dòng)力小鼠模型，通過ELISA、REAL-T

5、IME PCR、Western-blot、Southern-blot、IHC和CHIP等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行HBV再激活的體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，檢測順鉑是否可以在體內(nèi)誘導(dǎo)HBV再激活。實(shí)驗(yàn)研究順鉑誘導(dǎo)HBV再激活的分子機(jī)制：首先，篩選與HBV再激活相關(guān)的HBV啟動(dòng)子和肝富集轉(zhuǎn)錄因子；其次，選取其中代表性的轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α和HNF-4α進(jìn)行體內(nèi)外驗(yàn)證；通過CHIP等實(shí)驗(yàn)證明PGC-1α、HNF-4α在順鉑誘導(dǎo)HBV復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用；進(jìn)一步構(gòu)建PGC

6、-1α和HNF-4α的siRNA，體內(nèi)外反向驗(yàn)證PGC-1α和HNF-4α是否為順鉑誘導(dǎo) HBV再激活的關(guān)鍵因子；同時(shí)通過 ELISA、REAL-TIME PCR、Western-blot等實(shí)驗(yàn)篩選內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與HBV再激活的相關(guān)性及其關(guān)鍵因子。實(shí)驗(yàn)證實(shí)順鉑一方面可以通過直接上調(diào)HBV復(fù)制相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α和HNF-4α的表達(dá)，增強(qiáng)HBV核心啟動(dòng)子活性，繼而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)HBV的復(fù)制；另一方面可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)

7、激，UPR（未折疊蛋白反應(yīng)）誘發(fā)PGC-1α表達(dá)上調(diào)，間接上調(diào)HBV復(fù)制。
　　結(jié)論：化療藥物順鉑可以在體內(nèi)外直接增強(qiáng)HBV復(fù)制與轉(zhuǎn)錄從而誘導(dǎo)HBV再激活。其分子通路可能有兩條：1. PGC-1α和HNF-4α通路，肝富集轉(zhuǎn)錄因子 PGC-1α和 HNF-4α作為共激活因子，可以共同結(jié)合于 HBV DNA增強(qiáng)子Ⅰ和增強(qiáng)子Ⅱ上，順鉑可以直接上調(diào)肝富集轉(zhuǎn)錄因子 PGC-1α和 HNF-4α的表達(dá)，直接增強(qiáng)乙肝病毒的復(fù)制，引起HBV再激