人參皂苷Rg3增加肺癌順鉑藥物敏感性的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　肺癌是全球致死率最高的腫瘤類型，其治療方法的革新一直備受關(guān)注。順鉑是肺癌的一線化療藥物，但敏感性降低的問題限制了臨床應(yīng)用。敏感性降低可能與肺癌實(shí)體腫瘤發(fā)展過程中內(nèi)部形成的缺氧微環(huán)境相關(guān)。缺氧是由于腫瘤細(xì)胞增殖速度快于血管新生或異常新生血管引起的。缺氧改變實(shí)體腫瘤微環(huán)境，并與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和藥物敏感性有關(guān)。缺氧可促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和癌細(xì)胞的干細(xì)胞化，這有利于癌細(xì)胞生存。
　　EMT被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展惡化的驅(qū)動(dòng)

2、力，也被認(rèn)為是晚期腫瘤的重要特點(diǎn)。在EMT過程中，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin上調(diào);同時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子Snail激活，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)。隨著EMT的發(fā)生產(chǎn)生了一群具有多向分化潛能的腫瘤干細(xì)胞，這些腫瘤細(xì)胞又進(jìn)一步促使了腫瘤的轉(zhuǎn)移。干性標(biāo)記分子包括轉(zhuǎn)錄因子SOX2、NANOG、OCT4和表面標(biāo)志物CD44。缺氧引起癌細(xì)胞的這些轉(zhuǎn)變是由NF-κB信號(hào)通路激活介導(dǎo)的。
　　缺氧導(dǎo)致順鉑敏感性降低的問

3、題尚未研究清楚，聯(lián)合用藥有望解決這一問題。人參皂苷Rg3是從傳統(tǒng)中藥人參中提取的具有抗腫瘤作用的活性成分。在本研究中，評(píng)估了順鉑敏感性降低是否與缺氧有關(guān)，以及Rg3能否通過阻斷缺氧改善順鉑敏感性。
　　方法:
　　1.利用CoCl2來誘導(dǎo)缺氧，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HIF-1α蛋白表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　2.通過CCK-8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)比較順鉑在常氧和缺氧條件下的抗增殖作用，以及檢測(cè)缺氧條件下Rg3聯(lián)合順鉑的抗

4、增殖作用。
　　3.通過DAPI染色分析、AV-PI凋亡檢測(cè)法、Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡相關(guān)分子的表達(dá)比較順鉑在常氧和缺氧條件下的促凋亡作用，以及檢測(cè)缺氧條件下Rg3聯(lián)合順鉑的促凋亡作用。
　　4.通過細(xì)胞形態(tài)觀察、Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)比較常氧和缺氧條件下EMT的發(fā)生情況，以及檢測(cè)Rg3聯(lián)合順鉑的抑制作用。
　　5.通過球體形成實(shí)驗(yàn)、Western blot和免疫熒光

5、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干性相關(guān)蛋白表達(dá)比較常氧和缺氧條件下干性的發(fā)生情況，以及檢測(cè)Rg3聯(lián)合順鉑的抑制作用。
　　6.通過EMSA、Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞核和總蛋白NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白比較常氧和缺氧條件下NF-κB信號(hào)通路的激活情況，以及檢測(cè)Rg3聯(lián)合順鉑的抑制作用。Bay11-7082是NF-κB信號(hào)通路抑制劑，通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EMT和干性相關(guān)蛋白觀察NF-κB信號(hào)通路與EMT和干性發(fā)生的關(guān)系。

6、　　7.通過裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Rg3聯(lián)合順鉑的體內(nèi)療效，Western blot、免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)瘤組織EMT、凋亡和干性相關(guān)蛋白表達(dá)情況，驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　結(jié)果:
　　1.200μM CoCl2誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞形成體外缺氧微環(huán)境
　　Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明200μM CoCl2處理可使非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HIF-1α蛋白水平在48小時(shí)內(nèi)保持高表達(dá)。
　　2.缺氧條件下順鉑對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞

7、的抗增殖和促凋亡作用減弱
　　相同濃度順鉑作用肺癌細(xì)胞，缺氧細(xì)胞存活率和克隆形成率高于常氧，核染色質(zhì)凝集程度和凋亡率低于常氧，促凋亡蛋白(Caspase-3、-8、-9、Bax)和細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白(PARP)的表達(dá)均低于常氧，抗凋亡蛋白(Bcl-2、survivin)的表達(dá)均高于常氧。
　　3.缺氧誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞EMT和干性
　　缺氧細(xì)胞呈間質(zhì)化改變，HIF-1α、Snail、N-cadherin和Viment

8、in表達(dá)上調(diào)，而E-cadherin表達(dá)下調(diào)。缺氧細(xì)胞球體形成率比常氧條件下高，干性相關(guān)蛋白SOX2、NANOG、OCT4和CD44表達(dá)上調(diào)。
　　4.缺氧激活NF-κB信號(hào)通路的激活并介導(dǎo)EMT和干性的發(fā)生
　　缺氧條件下誘導(dǎo)的NF-κB DNA結(jié)合比常氧條件下更強(qiáng)。缺氧激活核蛋白提取物p-p65和p65以及細(xì)胞總蛋白提取物p-p65、p65、p-IKK和IKK表達(dá)。缺氧細(xì)胞NF-κB通路抑制后，EMT相關(guān)分子Snail、

9、N-cadherin和Vimentin下調(diào)，E-cadherin上調(diào)，干性相關(guān)分子SOX2、NANOG、OCT4和CD44下調(diào)。
　　5.Rg3聯(lián)合順鉑抑制缺氧激活的NF-κB信號(hào)通路
　　Rg3治療缺氧非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞減少p-p65和p65表達(dá)，并呈濃度和時(shí)間依賴性。缺氧條件下，Rg3聯(lián)合順鉑治療組NF-κBDNA結(jié)合低于兩藥單獨(dú)使用組，核蛋白提取物p-p65、p65以及總蛋白提取物p-p65、p65、p-IKK、IKK的

10、表達(dá)水平最低。
　　6.Rg3在體外增加缺氧人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性
　　Rg3聯(lián)合順鉑治療降低缺氧細(xì)胞活力和克隆形成率，增加核染色質(zhì)凝集和總凋亡率，Caspase-3、-8、-9、Bax和PARP高表達(dá)，Bcl-2和survivin低表達(dá)。
　　7.Rg3聯(lián)合順鉑抑制缺氧誘導(dǎo)的EMT和干性
　　Rg3聯(lián)合順鉑明顯逆轉(zhuǎn)了缺氧細(xì)胞的間質(zhì)化改變，Snail、N-cadherin和Vimentin低表達(dá)，E-c

11、adherm高表達(dá)，低球體形成率以及干細(xì)胞相關(guān)蛋白SOX2、NANOG、OCT4和CD44低表達(dá)。
　　8.Rg3增加人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞荷瘤裸鼠對(duì)順鉑的敏感性
　　Rg3聯(lián)合順鉑明顯減少瘤組織體積及重量。Rg3聯(lián)合順鉑治療降低了瘤組織HIF-1α、p-p65、p65、N-cadherin、SOX2、OCT4、Bcl-2和Survivin的表達(dá)，增加了E-cadherm、cleaved-caspase3和Bax的表達(dá)。