黃芪多糖通過多胺和鈣離子調(diào)節(jié)IEC-6細胞遷移的研究.pdf

1、研究背景：
　　胃腸黏膜損傷是胃腸道疾病的發(fā)病基礎(chǔ)之一。多種胃腸疾病存在胃腸黏膜損傷的病理改變。以益氣健脾法治療慢性胃炎、消化性潰瘍、炎癥性腸病等疾病證屬脾虛者有確切療效，益氣健脾方藥對胃腸道相關(guān)病癥的治療作用可能與其保護胃腸黏膜完整及促進黏膜損傷后修復的作用有密切關(guān)系。胃腸黏膜是人體更新最快的組織，具有很強的自我修復能力。胃腸黏膜損傷后修復包括快速整復階段和后續(xù)的修復階段?？焖僬麖碗A段主要在損傷后數(shù)分鐘至數(shù)小時發(fā)生，由損傷附近的

2、剩余的有活性的細胞向損傷部位遷移并重新覆蓋損傷部位，此過程不依賴細胞增殖。在小腸上皮細胞(IEC-6)的研究表明，多胺對細胞遷移是必需的。多胺可通過增加細胞電壓門控鉀通道蛋白Kv1.1表達、促進細胞膜電位超極化而調(diào)控Ca2+內(nèi)流驅(qū)動力;儲存操縱性鈣通道(SOC)是細胞Ca-2+內(nèi)流主要通道之一，TRPC1作為SOC通道蛋白，對調(diào)控Ca2+內(nèi)流驅(qū)動力和[Ca2+]cyt起重要作用。STIM1作為胞內(nèi)鈣庫Ca2+感應器是激活SOC的關(guān)鍵指標

3、;胞內(nèi)鈣庫Ca2+耗竭時STIM1從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)移位到漿膜與TRPC1形成STIM1/TRPC1復合體，進而增強TRPC1介導的Ca2+內(nèi)流而促進細胞遷移。STIM2是SOC的負調(diào)控蛋白，多胺通過改變ST1M1和ST1M2的比率而調(diào)控TRPC1介導的Ca2+信號;[Ca2+]cyt增加則激活下游的Rho-GTPases，MLC磷酸化增加，刺激應力纖維形成和細胞骨架重排而促進細胞遷移。
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)益氣健脾方藥如白術(shù)、黨參、黃

4、芪、甘草提取物（多糖、黃酮提取物等）及四君子湯糖等可促進IEC-6細胞遷移，作用機制與其影響多胺信號通路有關(guān)，其中Ca2+調(diào)控是關(guān)鍵指標。
　　研究目的：
　　篩選藥效活性較高的黃芪多糖組分為受試藥，觀察其對小腸上皮細胞(IEC-6)遷移過程多胺信號通路（尤其是Ca2+調(diào)控指標）的影響，探討益氣健脾中藥黃芪促進胃腸黏膜損傷修復的作用機制及藥效物質(zhì)，為其臨床治療胃腸黏膜損傷的療效機制提供參考。
　　研究方法：
　　

5、1.黃芪多糖提取、分離和純化:黃芪藥材經(jīng)水提醇沉法、Sevag去蛋白、DEAE-52纖維素柱層析、Sephadex葡聚糖柱層析，分別得到黃芪多糖1、2、3、4樣品;苯酚-硫酸法測定黃芪多糖各樣品的多糖含量;高效液相色譜法進行黃芪多糖3、4樣品純度分析。
　　2.在細胞遷移模型篩選受試藥:劃痕法IEC-6細胞遷移模型觀察黃芪多糖4種樣品對細胞遷移的影響，篩選出促進細胞藥理活性最佳的多糖樣品為后續(xù)研究受試藥。
　　3.作用機制指

6、標檢測:①RT-qPCR測定TRPC1、STIM1、STIM2 mRNA表達。②Western Blot檢測Kv1.1、TRPC1、STIM1、STIM2、RhoA、Rac1、Cdc42蛋白表達。③流式細胞儀測定細胞膜電位(Em)、細胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子水平([Ca2+]cyt)。④免疫熒光法檢測STIM1蛋白表達及分布。⑤免疫沉淀法檢測STIM1/TRPC1、STIM1/STIM2復合體蛋白表達。
　　研究結(jié)果：
　　1.黃芪

7、多糖提取、分離和純化:①黃芪多糖1、2、3、4的得率分別為:5.64％、3.34％、1.50％、6.5‰。②黃芪多糖1、2、3、4的多糖含量分別為31.0％、50.9％、66.3％、45％。以“黃芪多糖3”多糖含量最高。
　　2.黃芪多糖各樣品對細胞遷移的影響:黃芪多糖4種樣品均能促進細胞遷移，以“黃芪多糖3”促進細胞遷移藥效最佳，故確定為后續(xù)實驗受試藥。實驗劑量設為:20mg/L～160mg/L。
　　3.“黃芪多糖3”（

8、以下簡稱“黃芪多糖”）對細胞遷移的影響:黃芪多糖能促進細胞遷移，逆轉(zhuǎn)DFMO（多胺合成抑制劑）對細胞遷移的抑制，提示黃芪多糖促進細胞遷移的作用與其提高細胞內(nèi)多胺含量有關(guān)。
　　4.黃芪多糖對細胞遷移多胺信號通路Ca2+調(diào)控的影響
　　(1)對Ca2+調(diào)控上游指標的影響:①提高鉀通道蛋白Kv1.1表達;逆轉(zhuǎn)DFMO對Kv1.1表達的抑制;②提高細胞膜電位超極化水平，逆轉(zhuǎn)DFMO所致的膜電位去極化。提示黃芪多糖可通過激活鉀通道和

9、提高細胞膜電位而增加Ca2+內(nèi)流驅(qū)動力。
　　(2)對Ca2+調(diào)控指標的影響:①促進胞內(nèi)Ca2+感應器STIM1蛋白移位至細胞漿膜，改善DFMO對STIM1移位的抑制，提高STIM1在細胞膜的表達;②提高STIM1mRNA和蛋白表達，逆轉(zhuǎn)DFMO對STIM1 mRNA和蛋白表達的抑制;減少Ca2+負調(diào)控因子STIM2 mRNA和蛋白表達;抑制DFMO所致的STIM2 mRNA和蛋白表達的升高。③增加TRPC1/STIM1復合體蛋白

10、表達，減少STIM1/STIM2復合體蛋白表達;增加DFMO負荷時TRPC1/S TIM1復合體中TRPC1、STIM1蛋白表達;減少DFMO負荷下STIM1/STIM2復合體中STIM2蛋白表達。提示黃芪多糖可通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣庫Ca2+感應指標進而影響TRPC1介導的Ca2+信號。
　　(3)對鈣通道蛋白和[Ca2+]cyt的影響:①提高鈣通道蛋白TRPC1 mRNA和蛋白表達，減少DFMO所致的TRPC1 mRNA和蛋白表達抑制

11、;②提高[Ca2+]cyt，逆轉(zhuǎn)DFMO所致的[Ca2+]cyt降低;若去除細胞外Ca2+內(nèi)流途徑（使用無鈣培養(yǎng)液），則不但無鈣對照組細胞遷移數(shù)顯著減少，且黃芪多糖促進細胞遷移的作用也明顯減弱。提示黃芪多糖可通過增強TRPC1介導的Ca2+內(nèi)流、提高[Ca2+]cyt而促進細胞遷移。
　　(4)對Ca2+調(diào)控下游指標的影響:提高Rho-GTPase(RhoA、Rac1、Cdc42)蛋白表達;逆轉(zhuǎn)DFMO對RhoA、Rac1、Cdc