白術多糖通過多胺和Ca2+調節(jié)IEC-6細胞遷移及粘附連接蛋白的研究.pdf

1、研究背景：
　　胃腸黏膜損傷是脾虛證的臨床表現(xiàn)之一，益氣健脾是脾虛證的主要治法，胃腸黏膜保護是益氣健脾中藥的重要作用之一，含白術的益氣健脾方劑如四君子湯、補中益氣湯、參苓白術散等對胃腸黏膜損傷有修復作用。胃腸黏膜損傷修復過程包括上皮細胞遷移、增殖、分化、黏附連接和黏膜重建等環(huán)節(jié)，多胺對此過程是必需的且是焦點指標。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，益氣健脾中藥黃芪、白術、黨參、甘草及四君子湯的提取物（多糖、黃酮提取物等）能促進小腸上皮（IEC-

2、6）細胞遷移，提高多胺及其信號通路指標水平，并對相關抑制劑的抑制有逆轉作用，尤其提高細胞內鈣離子水平（[Ca2+]cyt）是關鍵指標之一;益氣健脾中藥提取物（黃芪、白術、黨參、甘草的多糖提取物及四君子湯水提物等）有防治大鼠應激性潰瘍的作用，作用機制與其影響胃或小腸黏膜多胺（精脒）含量有關;還對提取分離純化得到的白術多糖樣品進行了化學結構表征。本研究在此基礎上，選擇已經過結構表征的白術多糖樣品為受試藥，觀察其對IEC-6細胞遷移、鈣離子水

3、平、細胞黏附連接蛋白表達的影響，為探討益氣健脾中藥白術胃腸黏膜損傷修復作用機制提供參考。
　　研究目的：
　　觀察白術多糖對小腸上皮IEC-6細胞遷移、鈣離子水平([Ca2+]cyt)和細胞黏附連接蛋白（E-鈣黏蛋白、α-連環(huán)蛋白、β-連環(huán)蛋白）表達的影響，為探討益氣健脾中藥白術胃腸黏膜損傷修復作用機制提供參考。
　　研究方法：
　　(1)劃痕法復制細胞遷移模型。
　　(2)流式細胞儀檢測[Ca2+]cyt

4、。
　　(3) HE染色法觀察IEC-6細胞形態(tài)。
　　(4)WesternBlot法檢測E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-連環(huán)蛋白(α-catenin)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)表達。
　　(5)免疫熒光法觀察E-cadherin、α-catenin、β-catenin蛋白表達。
　　研究結果
　　(1)白術多糖對細胞遷移的影響
　?、俸}培養(yǎng)條件下，白術多糖（25或50或100m

5、g·L-1，下同）能促進細胞遷移，逆轉DFMO（多胺合成抑制劑）所致細胞遷移的抑制，提示白術多糖促進細胞遷移的作用與其影響細胞多胺有關。
　　②無鈣培養(yǎng)條件下（以不含Ca2+的培養(yǎng)液代替常規(guī)含Ca2+培養(yǎng)液）可致細胞遷移抑制(與含鈣培養(yǎng)對照組比較P＜0.01)，白術多糖在無鈣培養(yǎng)時對細胞遷移無明顯影響（與無鈣培養(yǎng)對照組比較P＞0.05），提示若去除胞Ca2+內流途徑，則白術多糖對細胞遷移的作用明顯減弱。
　　(2)白術多糖對

6、細胞遷移過程[Ca2+]cyt的影響
　　①含鈣培養(yǎng)條件下，白術多糖能提高細胞遷移過程[Ca2+]cyt，逆轉DFMO所致的[Ca2+]cyt降低。
　?、跓o鈣培養(yǎng)條件下，[Ca2+]cyt明顯降低（與含鈣對照組比較P＜0.05）;白術多糖對無鈣培養(yǎng)所致的[Ca2+]cyt降低無明顯影響（與無鈣對照組比較P＞0.05）。提示若去除胞Ca2+內流途徑，則白術多糖對[Ca2+]cyt的作用明顯減弱;結合白術多糖在無鈣培養(yǎng)條件下對

7、細胞遷移作用明顯減弱的結果，提示白術多糖促進細胞遷移和提高[Ca2+]cyt的作用可能與影響胞外Ca2+內流有關。
　　(3)白術多糖對細胞形態(tài)的影響
　　含鈣培養(yǎng)條件下，細胞與細胞之間邊緣突起較明顯，胞漿豐富，胞核較大，核仁增生活躍;無鈣培養(yǎng)條件下，細胞與細胞之間連接比較平滑，胞漿豐富，細胞核較大，核仁增生活躍。提示含鈣培養(yǎng)與無鈣培養(yǎng)對細胞形態(tài)的影響較小，兩者之間雖細胞形態(tài)稍有改變，但無本質區(qū)別。
　　白術多糖可稍微

8、改變無鈣培養(yǎng)所致的細胞之間較平滑的連接，可產生較短的細胞邊緣突起，但無法使細胞邊緣突起恢復至有鈣培養(yǎng)的形態(tài)。提示白術多糖對無鈣培養(yǎng)條件下細胞形態(tài)的影響輕微。
　　(4)白術多糖對細胞粘附連接蛋白表達的影響
　　對E-鈣黏蛋白表達的影響:白術多糖可提高E-鈣黏蛋白表達，逆轉DFMO所致E-鈣黏蛋白抑制，但不可逆轉無鈣培養(yǎng)所致的E-鈣黏蛋白表達抑制;提示白術多糖通過提高[Ca2+]cyt而增加E-鈣黏蛋白表達，其途徑可能主要通過

9、胞外Ca2+內流。
　　對α-連環(huán)蛋白表達的影響:白術多糖可提高α-連環(huán)蛋白表達，逆轉DFMO負荷和無鈣培養(yǎng)所致的α-連環(huán)蛋白表達抑制。
　　對β-連環(huán)蛋白表達的影響:白術多糖可提高β-連環(huán)蛋白表達;DFMO對β-連環(huán)蛋白表達有輕微抑制作用，白術多糖對DFMO所致的β-連環(huán)蛋白表達降低有改善作用;無鈣培養(yǎng)對β-連環(huán)蛋白表達無明顯影響，白術多糖對β-連環(huán)蛋白表達也無明顯影響。
　　白術多糖對粘附連接蛋白表達影響的結果表明

10、:①正常含鈣培養(yǎng)時，白術多糖可提高細胞遷移過程E-鈣黏蛋白、α-連環(huán)蛋白和β-連環(huán)蛋白表達;②含鈣培養(yǎng)加DFMO負荷時，白術多糖可逆轉DFMO所致的E-鈣黏蛋白、α-連環(huán)蛋白和β-連環(huán)蛋白表達降低，且對前兩種蛋白的作用更明顯;③無鈣培養(yǎng)時，白術多糖對E-鈣黏蛋白和β-連環(huán)蛋白表達無明顯影響，但可使α-連環(huán)蛋白表達維持在含鈣培養(yǎng)的正常水平。綜上結果，提示白術多糖對粘附連接蛋白表達的影響與目標蛋白的特點及不同負荷條件產生的影響有關。