四君子湯多糖對(duì)IEC-6細(xì)胞遷移多胺信號(hào)通路鈣離子調(diào)控影響的研究.pdf

1、目的:
　　觀察四君子湯多糖對(duì)小腸上皮細(xì)胞（IEC-6）遷移多胺信號(hào)通路Ca2+調(diào)控的影響，探討益氣健脾代表方劑四君子湯促進(jìn)胃腸粘膜損傷修復(fù)的作用機(jī)制，為其治療胃腸粘膜損傷病變的療效機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:
　　(1)四君子湯多糖提取分離純化:四君子湯經(jīng)水提醇沉、sevag法去蛋白、DEAE-52纖維素柱層析，分別得到四君子湯總多糖、粗多糖、純化多糖;苯酚-硫酸法檢測(cè)3種多糖樣品的多糖含量;HPLC法對(duì)四君子

2、湯純化多糖進(jìn)行純度分析。
　　(2)受試藥篩選及劑量確定:在IEC-6細(xì)胞遷移模型下觀察四君子湯總多糖、粗多糖、純化多糖對(duì)細(xì)胞遷移的影響，篩選出細(xì)胞遷移藥效較好的多糖樣品為本研究受試藥。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照藥精脒組（5μmol·L-1），四君子湯多糖40、80、160mg·L-1組（4-AP負(fù)荷實(shí)驗(yàn)設(shè)四君子湯多糖20、40、80mg·L-1組）;DFMO或4-AP負(fù)荷實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對(duì)照組，DFMO或4-AP模型組，精脒組和受

3、試藥組同時(shí)加入DFMO或4-AP。
　　(3)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):細(xì)胞劃痕損傷法造細(xì)胞遷移模型，相差倒置顯微鏡觀察細(xì)胞遷移情況。
　　(4)柱前衍生HPLC法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)多胺（精脒和精胺）含量。
　　(5)RT-qPCR法檢測(cè)Kv1.1、PLC-γ1、TRPC1mRNA表達(dá)。
　　(6)Western Blot法檢測(cè)Kv1.1、PLC-γ1、TRPC1、RhoA、Rac1、Cdc42蛋白表達(dá)。
　　(7)流式細(xì)胞儀

4、檢測(cè)細(xì)胞膜電位、[Ca2+]cyt。
　　(8)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)IP3含量。
　　(9)Pulldown assay法檢測(cè)GTP-RhoA、GTP-Rac1、GTP-Cdc42蛋白表達(dá)。
　　(10)免疫熒光法檢測(cè)myosinⅡ蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　(1)四君子湯多糖提取分離純化及藥效追蹤結(jié)果:①四君子湯總多糖、粗多糖、純化多糖的得率分別為5.42％、4.19％、2.44％;②四君子湯總多糖、粗多糖、純

5、化多糖的多糖含量分別為67.9％、72.4％、81.6％。③藥效追蹤結(jié)果提示四君子湯3種多糖樣品均能促進(jìn)細(xì)胞遷移;因四君子湯純化多糖藥效最佳，故確定其為本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)受試藥，實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)為20mg·L-1～160 mg·L-1，有效劑量40mg·L-1～160mg·L-1。
　　(2)四君子湯多糖對(duì)細(xì)胞遷移的影響:能促進(jìn)細(xì)胞遷移，逆轉(zhuǎn)DFMO（多胺合成抑制劑）負(fù)荷所致的細(xì)胞遷移抑制;提示四君子湯多糖促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用與影響多胺有關(guān)。

6、
　　(3)四君子湯多糖對(duì)細(xì)胞遷移多胺信號(hào)通路Ca2+調(diào)控上游指標(biāo)的影響:①能提高細(xì)胞內(nèi)多胺（精脒、精胺）含量，可逆轉(zhuǎn)DFMO所致的細(xì)胞內(nèi)多胺（精脒、精胺）含量降低。②能提高鉀通道蛋白Kv1.1mRNA和蛋白表達(dá)，可逆轉(zhuǎn)DFMO負(fù)荷所致Kv1.1mRNA和蛋白表達(dá)抑制;③可逆轉(zhuǎn)4-AP（鉀通道蛋白抑制劑）負(fù)荷所致的細(xì)胞遷移、Kv1.1mRNA和蛋白表達(dá)抑制;④能提高細(xì)胞膜電位以增加細(xì)胞膜電位超極化，可逆轉(zhuǎn)DFMO所致的細(xì)胞膜電位去

7、極化。提示四君子湯多糖可通過(guò)提高細(xì)胞多胺含量、激活鉀通道、增加細(xì)胞膜電位超極化，從而提高Ca2+內(nèi)流驅(qū)動(dòng)力。
　　(4)四君子湯多糖對(duì)細(xì)胞遷移多胺信號(hào)通路Ca2+調(diào)控的影響:①能增加細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]cyt，可逆轉(zhuǎn)DFMO所致的[Ca2+]cyt降低;②能提高鈣通道蛋白TPRC1mRNA和蛋白表達(dá)，能逆轉(zhuǎn)DFMO所致的TPRC1mRNA和蛋白表達(dá)抑制;③能提高胞內(nèi)鈣庫(kù)動(dòng)員指標(biāo)PLC-γ1mRNA和蛋白表達(dá)以及IP3含量，可逆轉(zhuǎn)DF

8、MO所致的PLC-γ1mRNA和蛋白表達(dá)抑制以及IP3含量降低;④若使用無(wú)Ca2+培養(yǎng)液以去除細(xì)胞外Ca2+，則不但空白對(duì)照組出現(xiàn)顯著的細(xì)胞遷移抑制，且四君子湯多糖促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用也明顯弱于使用含Ca2+培養(yǎng)液時(shí)。提示四君子湯多糖可通過(guò)促進(jìn)Ca2+內(nèi)流和胞內(nèi)鈣庫(kù)動(dòng)員兩途徑以增加[Ca2+]cyt，又以前者作用更明顯。
　　(5)四君子湯多糖對(duì)細(xì)胞遷移多胺信號(hào)通路Ca2+調(diào)控下游靶點(diǎn)的影響:①不但能提高Rho GTPase(Rho

9、A、Rac1、Cdc42)總蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)DFMO負(fù)荷所致的RhoA、Rac1、Cdc42總蛋白表達(dá)抑制;還能提高Rho GTPase激活形式的GTP-RhoA、GTP-Rac1、GTP-Cdc42蛋白表達(dá);②能提高細(xì)胞骨架myosinⅡ蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)DFMO所致的myosinⅡ蛋白表達(dá)抑制。提示四君子湯多糖可通過(guò)作用于Ca2+下游指標(biāo)如Rho GTPase和myosinⅡ以影響細(xì)胞骨架重排而促進(jìn)細(xì)胞遷移。
　　結(jié)論：