基于SGLT1通路探討四君子湯對Caco-2細胞葡萄糖吸收的影響.pdf

1、目的：
　　國內(nèi)經(jīng)多年研究，脾氣虛證患者存在腸道黏膜上皮細胞損傷及葡萄糖吸收的減少。益氣健脾法是中醫(yī)治療脾氣虛證的根本法則，益氣健脾方藥具有明顯的胃腸黏膜保護及改善脾氣虛證的葡萄糖吸收障礙的作用。本課題從體外培養(yǎng)細胞，研究觀察多胺對Caco-2細胞葡萄糖吸收和鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運載體1(SGLT1)通路的影響，并探討四君子湯“健脾助運”的機理是否與多胺對SGLT1通路介導的葡萄糖吸收作用有關(guān)，為闡明脾主運化、益氣健脾法及其方藥的作用

2、機制研究提供一個明確的靶點。
　　方法：
　　1.Caco-2細胞模型的建立
　　MTT法檢測細胞增殖;Caco-2細胞培養(yǎng)21天觀察其形態(tài)學變化及細胞微絨毛的結(jié)構(gòu);用電阻儀檢測細胞的跨膜電阻值(TEER)。
　　2.對Caco-2細胞黏膜的影響
　　大鼠分成兩組，空白對照組與四君子湯組，每天灌胃2次（四君子湯17 g·kg-1，空白對照組灌服等量生理鹽水），持續(xù)3d，最后一次給藥1h后腹主動脈取血，制備四

3、君子湯含藥血清，檢測細胞增殖與微絨毛結(jié)構(gòu)變化。
　　3.對Caco-2細胞葡萄糖攝取及消耗的影響
　　葡萄糖測定試劑盒及2-NBDG檢測Caco-2細胞對葡萄糖的攝取作用。
　　4.對Caco-2細胞SGLT1信號通路的影響
　　RT-PCR和Western blot檢測Caco-2細胞SGLT1及GLUT2 mRNA及蛋白表達水平的變化;流式細胞儀(Flow Cytometer，F(xiàn)CM)檢測細胞質(zhì)游離鈣離子([

4、Ca2+] cyt)水平;Western blot檢測Caco-2細胞P-MLC蛋白的表達。
　　5.對Caco-2細胞多胺含量的影響
　　柱前衍生一高效液相色譜法(HPLC)檢測細胞內(nèi)多胺含量。
　　結(jié)果：
　　1.Caco-2細胞模型的建立
　　MTT法制備的生長曲線表明，細胞對數(shù)生長期處于在第2d～6d，細胞形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，細胞在15～16 d左右已基本形成緊密的細胞單層;對培養(yǎng)21 d的Caco-2

5、細胞做透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細胞已分化出微絨毛;用電阻儀測定不同時間的Caco-2細胞單層的TEER值，發(fā)現(xiàn)在15～16 d左右，電阻已＞500Ω·cm2，顯示細胞單層已經(jīng)形成。
　　2.對Caco-2細胞黏膜的影響
　　MTT結(jié)果顯示，DFMO對Caco-2細胞的增殖有明顯抑制作用（P＜0.05），精脒(SPD)及四君子湯(SJZT)各劑量組均能改善DFMO的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01)，促進Caco-2細胞增殖;透

6、射電鏡觀察結(jié)果表明，DFMO組微絨毛明顯比對照組短（P＜0.05，＜0.01），且不規(guī)則，有破損;SPD及SJZT各劑量組均能改善DFMO對微絨毛生長的抑制作用(P＜0.05，P＜0.01)。
　　3.對Caco-2細胞葡萄糖攝取及消耗的影響
　　用倒置熒光顯微鏡觀察，Caco-2細胞能有效攝取2-NBDG，SPD及SJZT能促進正常Caco-2細胞攝取葡萄糖，且隨著SJZT濃度增強，其攝取葡萄糖的作用也越來越強;同時能改善

7、DFMO及根皮苷作用下Caco-2細胞對葡萄糖攝取的抑制作用;葡萄糖檢測試劑盒檢測結(jié)果顯示，SPD及SJZT能促進正常Caco-2細胞的葡萄糖消耗（P＜0.05，P＜0.01)，同時能改善DFMO和根皮甘對Caco-2細胞葡萄糖消耗的抑制作用，促進葡萄糖的吸收（P＜0.05，P＜0.01)。
　　4.對Caco-2細胞SGLT1信號通路的影響
　　Real-time PCR及Western blot結(jié)果顯示，根皮苷及DFMO

8、的SGLT1、GLUT2mRNA及蛋白表達均低于對照組（P＜0.05，P＜0.01);SPD和SJZT不僅可上調(diào)正常細胞SGLT1、GLUT2mRNA及蛋白表達水平（P＜0.05，P＜0.01)，還可逆轉(zhuǎn)根皮苷及DFMO對SGLT1、GLUT2mRNA及蛋白表達的抑制，表明SPD和SJZT能明顯提高葡萄糖轉(zhuǎn)運體mRNA及蛋白表達水平，且10％SJZT效果較明顯;FCM結(jié)果表明，根皮苷及DFMO組[Ca2+] cyt水平明顯低于對照組，S

9、PD及SJZT可提高細胞內(nèi)[Ca2+]cyt水平（P＜0.05，P＜0.01)，同時可逆轉(zhuǎn)根皮苷及DFMO的抑制作用(P＜0.05，＜0.01)，提高細胞內(nèi)[Ca2+]cyt濃度;Western blot檢測P-MLC蛋白水平，結(jié)果顯示，根皮苷及DFMO作用細胞后，P-MLC蛋白表達水平明顯低于對照組（P＜0.05，P＜0.01);加入SPD及四君子湯后，兩者不僅可提高P-MLC蛋白表達水平，還可逆轉(zhuǎn)根皮苷及DFMO對P-MLC蛋白表達

10、的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01)。
　　5.對Caco-2細胞多胺含量的影響
　　HPLC檢測細胞內(nèi)多胺含量結(jié)果表明，DFMO作用Caco-2細胞后，細胞內(nèi)多胺（腐胺、精脒和精胺）含量明顯減少(P＜0.05，P＜0.01)，SPD及SJZT不僅能提高正常Caco-2細胞內(nèi)多胺含量，同時可逆轉(zhuǎn)由DFMO所致的細胞內(nèi)多胺含量的降低(P＜0.05，P＜0.01)，提高細胞中多胺的含量。
　　結(jié)論：
　　1.Ca

11、co-2細胞模型的建立
　　在本實驗室培養(yǎng)的Caco-2細胞模型，符合體外研究小腸吸收實驗的條件，且在培養(yǎng)至15～16 d時可進行實驗。
　　2.對Caco-2細胞黏膜的影響
　　結(jié)構(gòu)影響功能，改善或促進腸黏膜上皮細胞的增殖及其結(jié)構(gòu)的改變，與細胞葡萄糖的吸收有關(guān)，四君子湯治療脾氣虛證的機理可能是通過改善小腸的吸收功能，修復受損的小腸組織細胞實現(xiàn)的，同時可能會影響葡萄糖相關(guān)轉(zhuǎn)運載體的表達，這有待于進一步的研究。
　

12、　3.對Caco-2細胞葡萄糖攝取及消耗的影響
　　多胺及四君子湯能使DFMO及根皮苷作用后Caco-2細胞的熒光強度增強，促進葡萄糖消耗的作用，可能與Caco-2細胞內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)運體有關(guān)，多胺及四君子湯可能通過影響葡萄糖相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白介導葡萄糖的吸收。
　　4.對Caco-2細胞SGLT1信號通路的影響
　　多胺及四君子湯促進Caco-2細胞增殖及葡萄糖吸收的作用與促進SGLT1、GLUT2蛋白表達有關(guān)，這一過程與多胺

13、的合成有著密切聯(lián)系;二者可通過增加Caco-2細胞內(nèi)多胺含量，提高[Ca2+]cyt和P-MLC蛋白表達水平，促進SGLT1通路介導的葡萄糖吸收，從而促進Caco-2細胞增殖，改善腸黏膜的修復作用。
　　5.對Caco-2細胞多胺含量的影響
　　多胺及四君子湯均能促進Caco-2細胞的增殖與葡萄糖吸收作用，改善微絨毛結(jié)構(gòu)，同時多胺對SGLT1介導的葡萄糖吸收的過程起著調(diào)節(jié)作用，四君子湯還能提高細胞內(nèi)多胺的含量，由此證明四君子