黃芪多糖通過干預(yù)CLP小鼠DC細(xì)胞對(duì)膿毒癥的影響及機(jī)制研究.pdf

1、膿毒癥即機(jī)體在遭受外界打擊時(shí)引起的全身炎癥反應(yīng)，膿毒癥發(fā)病過程就是一個(gè)免疫紊亂過程，早期主要表現(xiàn)為免疫過度，后期出現(xiàn)免疫抑制。在膿毒癥期間樹突狀細(xì)胞功能和分泌都是受到抑制的，激活或者恢復(fù)樹突狀細(xì)胞的活性，能夠很好地改善膿毒癥癥狀，因此我們可以將DC細(xì)胞作為治療膿毒癥的一個(gè)作用靶點(diǎn)，沿著這個(gè)思路，我們只需要尋找出一種能夠活化DC細(xì)胞的藥物是不是就可以達(dá)到治療膿毒癥的目的？
　　我國藥典中規(guī)定，中藥黃芪取自蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，

2、主要在我國的東北和華北地區(qū)分布，被廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)。近年來研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)黃芪有很多生物活性成分，如多糖、皂苷、黃酮等，其中以易得、便宜，成熟提取技術(shù)和明確的有效成分的黃芩多糖（APS）的研究為多。大量的科學(xué)實(shí)驗(yàn)證明APS對(duì)機(jī)體體液免疫與細(xì)胞免疫有著廣泛的影響，并能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌。我們實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)探討了發(fā)現(xiàn)APS能夠活化正常小鼠脾的DC，因此我們嘗試著將黃芪多糖（APS）作為靶點(diǎn)藥物，探討APS對(duì)膿毒癥時(shí)DC的作用關(guān)系，并為黃

3、芪多糖以DC為作用靶點(diǎn)治療膿毒癥提供臨床依據(jù)。
　　鑒于此，我們將本研究分為兩個(gè)部分探討：
　　第一部分，在體實(shí)驗(yàn)中初步探討APS干預(yù)CLP小鼠脾中的DC后，DC的數(shù)量、表型以及體內(nèi)相關(guān)炎癥因子的變化情況；
　　第二部分，體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確APS如何對(duì)DC產(chǎn)生作用，從而達(dá)到對(duì)膿毒癥小鼠有保護(hù)作用，通過細(xì)胞回輸，將理論結(jié)合應(yīng)用，為APS以DC作為靶點(diǎn)治療膿毒癥提供依據(jù)。
　　第一部分在體實(shí)驗(yàn)中初步探討APS對(duì)CLP

4、小鼠的DC亞群的影響
　　方法：
　　1、造模及分組，60只C57BL/6、SPF級(jí)健康雄性小鼠，應(yīng)用盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）制備成CLP膿毒模型鼠，分為四組（CLP、APS-50mg/g、APS-100mg/g、APS-200mg/g）。另取20只C57BL/6、SPF級(jí)健康雄性小鼠，應(yīng)用盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）制備成CLP膿毒模型鼠，分為四組（CLP、DC-105、DC-5x105、DC-106）。
　　2、獲取細(xì)胞：

5、免疫磁珠法分離純化小鼠脾的DC，50mg/g、100mg/g、200mg/g的APS體外注射到CLP小鼠腹腔，之后分別在1d、2d、3d、5d獲取脾的DC細(xì)胞（CLP造模當(dāng)天記為0d）。
　　3、觀察死亡率：CLP造模后第1d時(shí)在DC組小鼠分別腹腔注入105、5x105、106個(gè)DC細(xì)胞，對(duì)照組CLP注入生理鹽水，分別在第1d、2d、3d、5d觀察小鼠死亡情況。
　　4、采用酶聯(lián)吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)IL-10、IL-1

6、2、IL-6、TNF-α細(xì)胞因子表達(dá)。
　　5、熒光染色:經(jīng)CD11c-APC，CD45RB-PE抗體染色得到DC兩細(xì)胞亞群，DC標(biāo)染CD40、CD80、CD86、I-A\E得到其表面分子表達(dá)情況。
　　6、流式細(xì)胞術(shù)：（5）中標(biāo)染后抗體通過流式細(xì)胞儀表達(dá)，以及通過流式評(píng)估DC細(xì)胞數(shù)量的變化。
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用xs表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.

7、05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、在體實(shí)驗(yàn)中，正常DC注射到CLP小鼠可以提高其生存力，說明DC先天具有對(duì)CLP小鼠的保護(hù)作用；
　　2、APS注射到CLP小鼠體內(nèi)后，DC表面分子（CD40、CD80、I-A\E）與未經(jīng)處理的DC表面分子表達(dá)明顯增高，APS干預(yù)可以對(duì)DC表型分子表達(dá)增加。
　　3、APS注射到CLP小鼠體內(nèi)后得到脾的DC，DC數(shù)量與未經(jīng)處理的明顯增加，且對(duì)CD11chigh DCs

8、的影響呈劑量劑量依賴關(guān)系，而對(duì)CD45chigh DCs的影響呈有增有降的不穩(wěn)定趨勢(shì)；
　　4、從APS注射的CLP小鼠體內(nèi)脾的DC細(xì)胞上清中獲取的IL-12、IL-10檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CD11chigh DCs分泌的IL-12與APS呈劑量依賴關(guān)系，而與CD45chigh DCs分泌的IL-10呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；
　　5、從APS注射的CLP小鼠體內(nèi)脾的DC細(xì)胞上清中獲取的IL-6、TNF-γ檢測(cè)，發(fā)APS對(duì)CLP模型小鼠炎癥早期無

9、明顯影響，而很明顯地降低了后期炎癥因子的釋放。
　　結(jié)論:
　　在在體實(shí)驗(yàn)中初步發(fā)現(xiàn)APS能夠影響DC的功能和表型，并且可能主要在膿毒癥后期免疫抑制中發(fā)揮作用。
　　第二部分體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確APS如何對(duì)DC亞群分化產(chǎn)生作用，體內(nèi)細(xì)胞回輸明確APS對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用
　　方法：
　　1、模型鼠:20只C57BL/6、SPF級(jí)健康雄性小鼠，應(yīng)用盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）制備成CLP膿毒模型鼠，分為四組（CLP、AP

10、S-50ug/ml、APS-100ug/ml、APS-200ug/ml），造模當(dāng)天記為0d；
　　2、細(xì)胞培養(yǎng)：CD11chighDCs、CD45chighDCs各自獨(dú)立培養(yǎng)；CD11chighDCs、CD45chighDCs分別與CD4+T細(xì)胞混合培養(yǎng)；APS-50ug/ml、APS-100ug/ml、APS-200ug/ml與正常DC干預(yù)2h培養(yǎng)；
　　3、采用酶聯(lián)吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)小鼠眼底血或者上清中IL-10

11、、IL-12、IL-4、TNF-γ細(xì)胞因子的表達(dá)；
　　4、流式細(xì)胞術(shù)：分析CD11chigh DCs、CD45chigh DCs分別被APS刺激后的數(shù)量統(tǒng)計(jì)；
　　5、細(xì)胞回輸：分別取出105個(gè)APS刺激2h的DC體外腹腔注入CLP第1d時(shí)的小鼠體內(nèi)，在第1d、2d、3d、5d觀察小鼠死亡情況，并作記錄；
　　6、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用i±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方

12、差分析，P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、APS（50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml）刺激分別DC兩亞群，得到的DC數(shù)量圖和細(xì)胞因子圖發(fā)現(xiàn)APS刺激后CD11chighCD45RblowDCs的數(shù)量及IL-12的分泌都增加，并呈明顯劑量關(guān)系而對(duì)CD11clowCD45RbhighDCs及IL-10的分泌無明顯影響。初步說明APS對(duì)DC細(xì)胞的影響主要是影響CD11chigh DCs以及IL

13、-12的分泌。
　　2、APS（50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml）刺激的CD11chigh DCs和CD45chigh DCs分別于CD4+T細(xì)胞混合培養(yǎng)體系中檢測(cè)CD4+T細(xì)胞的相關(guān)細(xì)胞因子（IL-4、IFN-γ）檢測(cè)，表明APS可以更進(jìn)一步活化T淋巴細(xì)胞功能，進(jìn)而使Th2向Th1反應(yīng)轉(zhuǎn)移。
　　3、經(jīng)APS刺激后的DC回輸?shù)紺LP小鼠體內(nèi)后，CLP模型小鼠的生存力得到明顯的提高，與前面未經(jīng)APS刺激的D

14、C，回輸?shù)叫∈篌w內(nèi)后亦有明顯提高趨勢(shì)，初步說明通過體外對(duì)DC的功能干預(yù)，再回輸?shù)襟w內(nèi)對(duì)膿毒癥有保護(hù)作用。
　　結(jié)論：
　　體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確APS如何干預(yù)DC：誘導(dǎo)小鼠脾的樹突狀細(xì)胞向產(chǎn)IL-12的CD11chighCD45RBlow DC亞群分化，并且APS進(jìn)一步活化T淋巴細(xì)胞功能，進(jìn)而使Th2向Th1反應(yīng)轉(zhuǎn)移。此外，APS對(duì)T淋巴細(xì)胞向Th1分化與IL-10產(chǎn)生的CD11clowCD45RBhigh DC亞群無明顯影響。