硫氫化鈉對膿毒癥小鼠心肌線粒體的保護作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　選擇最合適盲腸結(jié)扎部位行盲腸結(jié)扎穿刺法(cecal ligation and puncture，CLP)，建立本實驗最適膿毒癥模型，首次探討膿毒癥對小鼠心肌線粒體生物合成的影響;給予不同濃度硫氫化鈉（sodium hydrosulfide，NaHS）干預，首次探討NaHS對膿毒癥小鼠心肌線粒體的保護作用、最佳濃度及相關(guān)機制，為膿毒癥動物實驗研究及臨床診治提供理論基礎。
　　方法:
　　1.取40只C57BL

2、/6小鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham)和CLP1、CLP2、CLP3組（分別結(jié)扎盲腸遠端1/4、1/2、3/4），比較小鼠生存情況，選擇最佳模型和取材時間點。
　　2.另取50只C57BL/6小鼠隨機分為CLP、CLP+NaHS（4亞組，NaHS濃度分別為25、50、100、200μmol/L）5組，比較小鼠生存情況。
　　3.另取70只C57BL/6小鼠隨機分為正常對照組（Control）、Sham、CLP、CLP+NaHS

3、（4亞組，NaHS濃度同前）7組，檢測和比較以下指標:
　　(1)小鼠膿毒癥表現(xiàn)。
　　(2)血漿內(nèi)毒素水平
　　(3)心肌損傷:HE染色觀察心肌細胞形態(tài)、ELISA檢測血清肌鈣蛋白(cardiac troponinⅠ，cTnⅠ)水平。
　　(4)心肌線粒體損傷:透射電鏡觀察線粒體形態(tài)學，分光光度法檢測線粒體腫脹程度，生物發(fā)光法檢測ATP水平。
　　(5)氧化應激:TBA法檢測丙二醛(malondialde

4、hyde，MDA)水平，DCFH-DA熒光探針法檢測活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平。
　　(6)抗氧化物:比色定量法檢測谷胱甘肽(glutathione，GSH)水平;Western Blot法檢測錳超氧化物歧化酶(Mn-superoxide dismutase，MnSOD)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)蛋白水平;RT-qPCR法檢測MnSOD、HO-1mRNA

5、水平。
　　(7)線粒體生物合成相關(guān)因子:RT-qPCR法檢測過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α，PGC-1α)、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid-2-related factor2，Nrf2)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription f

6、actorA，Tfam)mRNA水平。
　　結(jié)果:
　　1.CLP1、CLP2、CLP3組小鼠建模后開始死亡時間分別是12h、11h、8h，CLP1組小鼠48h存活率高于CLP2、CLP3組，故選擇CLP1為本研究實驗模型，建模后12h為取材時間點。
　　2.NaHS干預組小鼠48h存活率高于CLP組，100μmol/L組最高。
　　3.CLP組小鼠建模后6小時出現(xiàn)膿毒癥表現(xiàn)，逐漸加重;NaHS干預組膿毒癥表現(xiàn)減

7、輕，NaHS濃度越高，癥狀越輕。
　　4.CLP組內(nèi)毒素水平升高。
　　5.CLP組可見HE染色心肌細胞形態(tài)異常、cTnⅠ水平升高;NaHS干預組心肌細胞形態(tài)異常減輕、cTnⅠ水平下降，NaHS濃度越高作用越明顯。
　　6.CLP組心肌線粒體形態(tài)異常、腫脹程度增加、ATP水平下降;NaHS干預后線粒體形態(tài)異常及腫脹程度減輕，ATP水平升高，NaHS濃度越高作用越明顯。
　　7.CLP組ROS、MDA水平升高;與C

8、LP組比較，各濃度NaHS組MDA水平均下降，但100、200μmol/L組間無顯著性差異，ROS水平僅100、200μmol/L組下降。
　　8.CLP組GSH水平下降、MnSOD、HO-1蛋白及mRNA水平上升;NaHS干預組其水平均較CLP組上升，且呈NaHS濃度依賴性，200μmol/L組MnSOD、HO-1蛋白水平低于100μmol/L組。
　　9.CLP組PGC-1α、Nrf2、Tfam mRNA水平均上升;Na

9、HS干預組較CLP組繼續(xù)上升，NaHS濃度越高，上升越明顯。
　　10.CLP組和NaHS干預組cTnⅠ水平、線粒體腫脹程度均與ROS、MDA水平呈正相關(guān)，ATP水平與ROS、MDA水平呈負相關(guān);NaHS干預組ROS、MDA水平與GSH水平、MnSOD及HO-1mRNA水平呈負相關(guān)，ATP、GSH水平及MnSOD、HO-1、Tfam mRNA水平均與PGC-1α、Nrf2mRNA水平呈正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.膿毒