siRNA干擾Slug基因表達(dá)對(duì)IEC-6細(xì)胞放射線敏感性影響.pdf

1、目的：通過研究siRNA干擾Slug基因表達(dá)對(duì)體外腸隱窩細(xì)胞IEC-6接受X線照射的敏感性影響及機(jī)制，探討 Slug基因?qū)δc道干細(xì)胞的保護(hù)作用，為減輕正常腸道組織的輻射損傷尋求新的策略。
　　方法：（1）以體外培養(yǎng)的大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞 IEC-6為研究對(duì)象，針對(duì)已知的Slug基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)并合成3條特異性序列（siRNA-Slug-1、siRNA-Slug-2、siRNA-Slug-3）和1條非特異性序列（siRNA-

2、NC）。（2）利用銳博生物公司提供的轉(zhuǎn)染技術(shù)對(duì) IEC-6細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為三組，分別為：實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染 siRNA-Slug小干擾RNA，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染siRNA Negative Control（siRNA-NC），空白對(duì)照組不轉(zhuǎn)染任何小干擾RNA。（3）在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，選擇最佳轉(zhuǎn)染濃度和轉(zhuǎn)染時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（4）采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞Slug基因被干

3、擾后在蛋白水平的表達(dá)變化，以及Slug基因被沉默的同時(shí)PUMA蛋白水平的表達(dá)變化。（5）通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默Slug基因聯(lián)合放療對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖情況的影響。（6）流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。（7）克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察 IEC-6細(xì)胞的放射敏感性。（8）采用SPSS21.0和GraphPad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料結(jié)果以?χ± S形式表示，數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4、
　　結(jié)果：（1）利用銳博生物公司提供的轉(zhuǎn)染技術(shù)能夠成功將siRNA-Slug瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入IEC-6細(xì)胞。（2）利用Western blot成功篩選出干擾效果最好的siRNA-Slug。同時(shí)Western blot結(jié)果顯示：經(jīng)X線照射，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)的Slug蛋白表達(dá)與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比明顯降低（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的 PUMA蛋白表達(dá)明顯高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.01），且隨著實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)的Slug蛋白表達(dá)的

5、下調(diào)，PUMA的蛋白表達(dá)增高。（3）CCK8結(jié)果顯示在0~6Gy劑量范圍內(nèi)，隨著X線劑量的增加，細(xì)胞的增殖活性降低；在6Gy劑量下，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，生長(zhǎng)抑制率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（4）流式細(xì)胞術(shù)顯示經(jīng)X射線照射后，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（5）細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)