激活A(yù)MPK調(diào)控外周及中樞敏化治療慢性疼痛的實驗研究.pdf

1、慢性疼痛是危害人類健康的嚴重問題。數(shù)據(jù)顯示，全球成人慢性疼痛的平均發(fā)病率約為30％，由于其病因復(fù)雜，發(fā)病機制尚不明確，治療非常困難。長期遭受慢性疼痛的患者，極易伴隨著焦慮、失眠、憂郁、抑郁等癥狀，不僅耗費大量醫(yī)療資源，患者自身的生活質(zhì)量也嚴重下降。因此，如何有效的治療慢性疼痛已經(jīng)成為臨床急待解決的挑戰(zhàn)性問題。
　　慢性疼痛的類型主要有以下幾種，包括組織損傷（例如關(guān)節(jié)炎）后的炎性疼痛，癌癥疼痛和神經(jīng)損傷、脊髓損傷和腦損傷后的神經(jīng)性疼

2、痛（例如中風和創(chuàng)傷）。慢性疼痛的特征通常在于痛覺過敏，其是對有害的熱和機械刺激以及異常性疼痛的增加的反應(yīng)，其中傷害性反應(yīng)發(fā)生于正常無害的刺激，例如輕微接觸（稱為機械性異常性疼痛）。神經(jīng)性疼痛的特征還在于灼燒疼痛，感覺異常（刺痛感，瘙癢）和感覺遲鈍（不愉快的，異常的觸覺）。
　　緩解慢性疼痛的常規(guī)藥物治療如非甾體類抗炎藥、阿片類藥物等并不能很好的控制疾病，而目前有一種新型的治療手段在臨床上使用很廣泛，且很多臨床報道證實其效果顯著，即

3、臭氧治療。臭氧在疼痛方面的應(yīng)用已經(jīng)有一百多年的歷史，1988年，意大利醫(yī)生Verga將臭氧注入腰大肌及椎旁間隙治療腰腿痛。1998年，Muto等報道將臭氧注入椎間盤及椎旁間隙治療腰椎間盤突出癥，有效率為78％。1994～2000年，Albertini報告6665例多中心治療腰椎間盤突出癥的研究結(jié)果，有效率為80.9％。亞洲和東歐某些地區(qū)，如羅馬、意大利、俄羅斯等都廣泛的將臭氧應(yīng)用于臨床。在中國，醫(yī)用臭氧作為一個非常重要的治療神經(jīng)病理性疼

4、痛的替代療法，被廣泛用于椎間盤突出癥、關(guān)節(jié)疾病、肩周炎、偏頭痛、周圍血管缺血性疾病及帶狀皰疹后遺疼痛等。雖然如今臭氧在疼痛類疾病的應(yīng)用中十分廣泛，但很少有學者研究臭氧治療疼痛的機理，而臭氧對疼痛有確切療效的實驗學證據(jù)更是空白。這對臭氧的規(guī)范使用缺少了很多的指導證據(jù)。
　　本實驗室的前期研究結(jié)果與神經(jīng)科學領(lǐng)域的前沿研究均提示:磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosine mono-phosphate-activated protein

5、 kinase，AMPK)，在痛覺調(diào)制中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。AMPK是一個位于真核細胞中的絲氨酸-蘇氨酸激酶，是細胞中感受能量應(yīng)激并調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝的關(guān)鍵分子。AMPK由催化性的α亞基和調(diào)控性的β，γ亞基組成，在不同的組織和細胞中組成多種異三聚體發(fā)揮蛋白質(zhì)激酶活性。是真核細胞中極為關(guān)鍵的能量平衡感受器和調(diào)控者。AMPK最經(jīng)典的激活通路是能量應(yīng)激使ATP迅速消耗導致的AMP/ATP比值增加。AMPK經(jīng)典的激動劑包括白藜蘆醇、二甲雙胍等。白藜

6、蘆醇（芪三酚）作為一種天然多酚類物質(zhì)，是天然的抗氧化劑。白藜蘆醇不僅可抑制血小板凝結(jié)、降低血液的粘稠度、舒張血管，從而保持血液暢通，還可以預(yù)防癌癥的產(chǎn)生及發(fā)展。再者它還具有抗動脈粥樣硬化和冠心病及治療缺血性心臟病和高血脂的作用。
　　最近的研究表明，AMPK不僅是一個能量響應(yīng)性酶，它也檢測氧化還原信號。臭氧具有強氧化性，所以臭氧起效的分子機制可能與AMPK密切相關(guān)。但是，臭氧是否是通過激活A(yù)MPK從而通過調(diào)節(jié)相關(guān)神經(jīng)炎癥來治療疼痛

7、，尚未見文獻報道。因此，我們利用臭氧、白藜蘆醇通過不同的慢性疼痛模型，對AMPK在慢性疼痛中的作用機制進行研究。
　　第一部分臭氧激活A(yù)MPK治療神經(jīng)病理性疼痛的機制研究
　　目的:研究臭氧對AMPK的作用，以及抑制神經(jīng)病理性疼痛的分子機制
　　方法:利用免疫印跡法檢測臭氧對AMPK的影響;測定經(jīng)典的疼痛行為學指標——大鼠縮足反射閾值，考察臭氧對神經(jīng)病理性疼痛行為學的影響;利用免疫印跡法檢測臭氧對于神經(jīng)病理性疼痛標志性

8、分子指標NR1、NR2B、PKCγ、 ERK的影響;利用免疫印記和免疫熒光法檢測臭氧對于脊髓小膠質(zhì)細胞活化程度的影響。利用免疫印記和免疫熒光法檢測臭氧對于體外培養(yǎng)的巨噬細胞中的AMPK和NF-κB的影響。
　　結(jié)果:臭氧可以減輕CCI導致的大鼠神經(jīng)病理性疼痛所致的機械學超敏，能降低與中樞敏化密切相關(guān)的NR1、NR2B、PKCγ和ERK的磷酸化水平。同時，臭氧能夠在體內(nèi)外顯著激活A(yù)MPK。AMPK的激動劑AICAR和A769662可

9、以很好的模擬臭氧的作用，減輕疼痛，同時臭氧的鎮(zhèn)痛作用能夠被AMPK抑制劑Compound C劑量依賴性的取消。在體外培養(yǎng)的巨噬細胞中臭氧能夠抑制NF-κBp65的核轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)論:臭氧能夠通過激活A(yù)MPK，進而抑制神經(jīng)病理性疼痛誘導的炎癥反應(yīng)，使得其能夠治療神經(jīng)病理性疼痛。AMPK可能成為治療神經(jīng)病理性疼痛的潛在臨床靶點，促進臭氧的臨床應(yīng)用。
　　第二部分白藜蘆醇激動AMPK治療骨癌痛的機制研究
　　目的:研究白藜蘆

10、醇對骨癌痛的影響及其作用機制
　　方法:測定經(jīng)典的疼痛行為學指標——大鼠縮足反射閡值，考察白藜蘆醇對骨癌痛行為學的影響;利用免疫印跡法檢測骨癌痛模型中AMPK的磷酸化水平，以及白藜蘆醇對其的影響;利用免疫熒光法檢測白藜蘆醇對于AMPK、脊髓小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞活化程度、MAPK家族的影響。利用免疫印跡法檢測白藜蘆醇對AKT、mTOR磷酸化水平的影響;利用體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞，檢測白藜蘆醇對AMPK及MAPK家族的

11、影響。
　　結(jié)果:白藜蘆醇可以減輕TCI導致的大鼠機械學超敏。白藜蘆醇可以顯著增加神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞上的AMPK的磷酸化水平，能降低TCI引起的異常升高的MAPK家族、AKT和mTOR的磷酸化水平。同時，白藜蘆醇能夠抑制體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞上的MAPK家族的磷酸化水平，及神經(jīng)元上的AKT和mTOR的磷酸化水平。
　　結(jié)論:白藜蘆醇能通過激活A(yù)MPK抑制MAPK信號通路，進而抑制星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)