AMPK激活促自噬反應(yīng)參與心肌慢性缺氧適應(yīng)的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)是嬰幼兒常見(jiàn)的疾病之一，目前CHD整體的手術(shù)治愈率較以前已明顯改善，但紫紺型先天性心臟病(cyanoticcongenital heart disease，CCHD)的手術(shù)死亡率仍然較高。慢性缺氧(chronic hypoxia)是大部分CCHD病的共有的病理生理過(guò)程。目前CCHD的心肌慢性缺氧適應(yīng)的分子機(jī)制尚不清楚。因此，深入研究心肌細(xì)

2、胞慢性缺氧適應(yīng)的分子機(jī)制可為改善CCHD的臨床治療提供新的心肌保護(hù)策略。
　　AMPK是廣泛存在于真核細(xì)胞的Ser/Thr蛋白激酶，已有研究證實(shí)，在慢性缺氧條件下，活化的AMPK參與心肌細(xì)胞能量代謝。新近研究表明，在腫瘤細(xì)胞中，活化的AMPK和自噬反應(yīng)密切相關(guān)。我們推測(cè):在心肌細(xì)胞慢性缺氧適應(yīng)中，AMPK可能通過(guò)調(diào)節(jié)白噬對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。本研究擬從下面三個(gè)方面進(jìn)行驗(yàn)證:1.檢測(cè)活化AMPK在慢性缺氧心肌組織中的表達(dá)水平;2.

3、研究AMPK活化水平對(duì)心肌細(xì)胞慢性缺氧適應(yīng)的影響;3.探討AMPK活化水平對(duì)慢性缺氧心肌細(xì)胞自噬水平的影響。
　　研究方法:
　　1.選用清潔級(jí)4-6周齡雄性SD大鼠24只，隨機(jī)將其平均分為常氧組和缺氧組。將缺氧組置入低壓艙（模擬海拔5000m，氣壓405mmHg），常氧組正常飼養(yǎng)。同時(shí)喂養(yǎng)28d后，處死大鼠后迅速取出心臟并分離出右心室部分作為標(biāo)本;入選第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管外科2013年全年行手術(shù)矯治的先心病患兒2

4、4例，平均將其分為紫紺組和非紫紺組，于術(shù)中收集切除的右室流出道心肌組織作為標(biāo)本。采用Westernblot分別檢測(cè)p-AMPK在大鼠、人體缺氧和正常心肌組織中的表達(dá)水平。
　　2.選用H9c2心肌細(xì)胞株，并將其分為常氧組、低氧組、阻斷組、激活組。將低氧組、阻斷組、激活組三組細(xì)胞置入缺氧培養(yǎng)箱3d(94％ N2，5％ CO2，1％ O2)，建立H9c2心肌細(xì)胞株慢性缺氧模型;常氧組置入細(xì)胞培養(yǎng)箱3d(74％ N2，5％ CO2，21

5、％ O2)，對(duì)照培養(yǎng)。分別向阻斷組和激活組中加入AMPK特異性阻斷劑Compound C和激活劑AICAR，采用Western blot驗(yàn)證活化AMPK的表達(dá)，流式細(xì)胞儀、TUNEL法檢測(cè)并評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞凋亡情況，Hoechst染色觀察因細(xì)胞壞死引起的細(xì)胞核形態(tài)變化、LDH測(cè)定心肌細(xì)胞乳酸釋放率評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞壞死程度。
　　3.采用Western blot分別檢測(cè)常氧組、缺氧組、阻斷組和激活組LC3的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:

6、>　　1.AMPK在正常和慢性缺氧組織中的激活水平
　　Western blot結(jié)果顯示與正常心肌組織相比，缺氧心肌組織中p-AMPK/AMPK比值明顯增高:在人體心肌組織方面，紫紺組心肌組織AMPK蛋白磷酸化水平和非紫紺組相比，明顯增加，P＜0.005;在大鼠心肌組織方面，慢性缺氧組SD大鼠心肌組織中AMPK蛋白激活水平和常氧組相比，明顯增加，P＜0.005。
　　2.AMPK激活對(duì)慢性缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用
　　(

7、1)心肌細(xì)胞AMPK激活水平驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，Western blot結(jié)果顯示與低氧組相比，阻斷組AMPK激活水平降低，P＜0.01;激活組AMPK激活水平升高，P＜0.01。
　　(2)與低氧組相比，阻斷組心肌細(xì)胞凋亡水平升高，與此同時(shí)，激活組心肌細(xì)胞凋亡水平降低。
　　細(xì)胞流式術(shù):與低氧對(duì)照組相比，AMPK阻斷組凋亡細(xì)胞比例明顯增多，與此同時(shí)，AMPK激活組凋亡細(xì)胞比例明顯減少。
　　TUNEL實(shí)驗(yàn):與低氧對(duì)照組相比，A

8、MPK阻斷組TUNEL-陽(yáng)性細(xì)胞比例增多(P＜0.05)，與此同時(shí)，AMPK激活組TUNEL-陽(yáng)性細(xì)胞減少(P＜0.05)。
　　(3)與低氧組相比，阻斷組心肌細(xì)胞壞死程度增高，與此同時(shí)，激活組心肌細(xì)胞壞死程度降低。
　　Hoechst染色:與低氧對(duì)照組相比，AMPK阻斷組不正常核細(xì)胞比例明顯增多(P＜0.01)，與此同時(shí)，AMPK激活組不正常核細(xì)胞比例減少(P＜0.05)。
　　LDH實(shí)驗(yàn):與低氧對(duì)照組相比，AMPK

9、阻斷組細(xì)胞乳酸釋放率明顯升高(P＜0.01)，與此同時(shí)，AMPK激活組細(xì)胞乳酸釋放率明顯降低(P＜0.05)。
　　3.AMPK激活對(duì)慢性缺氧心肌細(xì)胞自噬反應(yīng)的影響Western blot結(jié)果顯示與心肌細(xì)胞低氧組相比，AMPK阻斷組自噬水平(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)明顯降低，P＜0.01; AMPK激活組自噬水平(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)明顯升高，P＜0.01。
　　結(jié)論:
　　1.紫紺型先心病和慢性缺氧SD大鼠的心肌組織中p

10、-AMPK/AMPK比值與非紫紺型先心病和常氧SD大鼠的心肌組織相比明顯增高。提示慢性缺氧心肌組織中AMPK激活水平明顯增加。
　　2.慢性缺氧條件下培養(yǎng)H9c2細(xì)胞72h，加入Compound C阻斷AMPK激活，H9c2細(xì)胞凋亡和壞死水平增高;加入AICAR促進(jìn)AMPK激活，H9c2細(xì)胞凋亡和壞死水平降低。提示在心肌慢性缺氧適應(yīng)中，AMPK激活對(duì)H9c2細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。
　　3.慢性缺氧條件下培養(yǎng)H9c2細(xì)胞72