曲美他嗪促進(jìn)AMPK依賴的自噬流減輕心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷.pdf

1、研究目的:
　　觀察曲美他嗪(Trimetazidine，TMZ)預(yù)處理能否有效減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(Hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷，并探索心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧期間，曲美他嗪預(yù)處理是否經(jīng)過(guò)單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)通路調(diào)控自噬。
　　研究方法:
　　第一部分實(shí)驗(yàn):觀察H/R過(guò)程中曲美他嗪的保護(hù)作用，并確定最有效濃度。
　　

2、構(gòu)建新生大鼠心肌細(xì)胞H/R模型，研究對(duì)象隨機(jī)分為對(duì)照組、H/R組、H/R+TMZ（10μM）組、H/R+TMZ(50μM)組、H/R+TMZ(100μM)組。采用MTS檢測(cè)細(xì)胞活性，收集培養(yǎng)液并通過(guò)試劑盒檢測(cè)LDH水平以觀察細(xì)胞損傷程度，比較各濃度療效，確定最有效濃度。
　　第二部分實(shí)驗(yàn):探明曲美他嗪對(duì)H/R過(guò)程中自噬的影響及干預(yù)自噬表達(dá)對(duì)曲美他嗪療效影響
　　本部分實(shí)驗(yàn)主要采用氯喹(chloroquine，Cq)抑制自噬流

3、，實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組、對(duì)照+TMZ組、對(duì)照+Cq組、H/R組、H/R+TMZ組、H/R+Cq組、H/R+TMZ+Cq組。MTS檢測(cè)細(xì)胞活性，試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液LDH水平，并通過(guò)Western blot半定量分析自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3和p62的表達(dá)，轉(zhuǎn)染病毒mRFP-GFP-LC3并通過(guò)共聚焦顯微鏡以測(cè)定細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白分布情況，透射電鏡直接觀察各組自噬體數(shù)量，TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡水平。
　　第三部分實(shí)驗(yàn):探明H

4、/R過(guò)程中干預(yù)AMPK對(duì)曲美他嗪所調(diào)控的自噬的影響
　　本部分實(shí)驗(yàn)主要使用compound C(com C)抑制AMPK信號(hào)，實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組、對(duì)照+ com C組、H/R組、H/R+TMZ組、H/R+com C組、H/R+TMZ+ comC組。MTS檢測(cè)細(xì)胞活性，試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液LDH水平，最后通過(guò)Western blot半定量分析自噬相關(guān)蛋白LC3和p62及AMPK信號(hào)通路蛋白p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR的表

5、達(dá)。
　　研究結(jié)果:
　　1.曲美他嗪預(yù)處理減輕心肌細(xì)胞H/R損傷
　　與對(duì)照組相比，H/R組的細(xì)胞活性顯著性下降(P＜0.05);各曲美他嗪預(yù)處理組細(xì)胞活性均比H/R組高(P＜0.05)，H/R+TMZ(50μM)組細(xì)胞活性比H/R+TMZ(10μM)組高(P＜0.05)，但與H/R+TMZ(100μM)組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。因此50μM為曲美他嗪的最有效濃度。
　　2.曲美他嗪預(yù)處理在心肌細(xì)胞H/R

6、期間促進(jìn)自噬流
　　H/R處理后各自噬相關(guān)蛋白均表達(dá)上調(diào)（P＜0.05，C vs.H/R組），然而曲美他嗪預(yù)處理后Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均進(jìn)一步增強(qiáng)，p62減少(P＜0.05，H/Rvs.H/R+ TMZ組);透射電鏡結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，HR組細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)更多自噬體，(P＜0.05);而相比H/R組，H/R+TMZ組自噬體數(shù)量進(jìn)一步增加(P＜0.05)。共聚焦顯微鏡下，對(duì)照組無(wú)明顯LC3聚集現(xiàn)象;H/R處理

7、后，自噬體數(shù)量明顯增加(P＜0.05，Cvs.H/R組);與H/R組相比，H/R+TMZ組的自噬溶酶體更多(P＜0.05)。
　　3.Cq預(yù)處理抵消曲美他嗪對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用
　　Cq預(yù)處理后，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62的表達(dá)均增加(P＜0.05，H/R+ TMZ vs.H/R+TMZ+Cq組);共聚焦顯微鏡下，Cq預(yù)處理顯著減少自噬溶酶體(P＜0.05，H/R+TMZ vs.H/R+ TMZ+ Cq組）;與H/R+T

8、MZ組相比，H/R+TMZ+Cq組細(xì)胞活性明顯下降(P＜0.05);
　　4.曲美他嗪預(yù)處理減少H/R中細(xì)胞凋亡
　　TUNEL染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H/R組凋亡細(xì)胞顯著性增加(P＜0.05);曲美他嗪預(yù)處理后，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05，H/R vs.H/R+ TMZ組）;然而H/R+TMZ+Cq與H/R+ TMZ組相比，凋亡細(xì)胞顯著性增加(P＜0.05)。
　　5.曲美他嗪預(yù)處理通過(guò)AMPK-mTOR

9、調(diào)控H/R中的自噬
　　與H/R組相比，曲美他嗪預(yù)處理顯著增加p-AMPK/AMPK的比值以及減少p-mTOR/mTOR的比值（P＜0.05，H/R vs.H/R+ TMZ組）;與H/R+ TMZ組相比，compound C減少p-AMPK/AMPK比值，增加p-mTOR/mTOR比值(P＜0.05);此外，compound C減少LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值并增加了p62的表達(dá);H/R+TMZ+com C與H/R+ TMZ組相比，