MIF和AMPK在心肌慢性缺氧適應(yīng)中意義的實驗研究.pdf

1、背景與目的： 紫紺型先心病是臨床常見的先天性畸形，心肌慢性缺氧是此類患者共同的病理生理過程。心肌慢性缺氧適應(yīng)是促進心肌細胞存活和生長的關(guān)鍵，但是心肌慢性缺氧適應(yīng)的確切機制尚不清楚。 慢性缺氧時心肌細胞能量代謝調(diào)節(jié)是心肌慢性缺氧適應(yīng)的主要環(huán)節(jié)。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)能夠增加缺氧時心肌細胞的能量合成和利用，可能是慢性缺氧時心肌細胞能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵激酶；巨噬細胞移動抑制因子(MIF)被認為是心肌細胞氧狀態(tài)的感受因子，

2、能在急性缺血條件下，誘導(dǎo)心肌細胞中AMPK活化，可能是慢性缺氧條件下AMPK活化的主要誘導(dǎo)因子。深入研究慢性缺氧對心肌細胞中MIF表達和AMPK活化的影響，以及MIF表達與AMPK活化的相互關(guān)系，將有助于深化對慢性缺氧條件下心肌細胞能量代謝調(diào)節(jié)的認識。本實驗分別在紫紺型先天性心臟病患兒心肌組織標本和體外培養(yǎng)的心肌細胞慢性缺氧模型上，研究慢性缺氧對心肌細胞中MIF表達以及AMPK活化的影響，并探討MIF和AMPK在心肌慢性缺氧適應(yīng)中的意義

3、。 研究方法： 本研究分兩部分： 第一部分：選取紫紺型和非紫紺型先天性心臟病患兒，收集手術(shù)中切除的肥厚右室流出道心肌組織。免疫組化觀察HIF-1α和MIF在心肌組織中的表達；提取心肌組織的總RNA，采用RT-PCR檢測HIF-1α和MIF mRNA表達水平；提取心肌組織的總蛋白，應(yīng)用Western blot檢測HIF-1α和MIF蛋白表達水平和AMPK磷酸化水平；同時，將HIF-1α和MIF基因和蛋白水平與患兒術(shù)

4、前末梢血氧飽和度SaO2進行相關(guān)性分析。 第二部分：體外培養(yǎng)大鼠原代心室肌細胞和H9c2大鼠心肌細胞株，將細胞暴露于1％ O2、5％ CO2的環(huán)境中建立缺氧細胞模型，比較大鼠原代心室肌細胞和H9c2大鼠心肌細胞株在MIF表達和AMPK活化上的差異，并在培養(yǎng)過程中應(yīng)用MTT法檢測心肌細胞的生長情況。培養(yǎng)不同時間段后，提取心肌細胞的總RNA，應(yīng)用RT-PCR檢測MIF mRNA表達水平的變化；提取心肌細胞的總蛋白，應(yīng)用Western

5、 blot檢測MIF蛋白表達的變化和AMPK磷酸化水平的改變，并采用SAMS法檢測AMPK激酶活性的變化情況。 研究結(jié)果： 主要結(jié)果如下： 1、與非紫紺組相比，紫紺型先天性心臟病患兒心肌組織中HIF-1α蛋白表達明顯增強(p<0.001)。免疫組化檢測表明HIF-1α在胞漿和胞核內(nèi)均有表達。HIF-1α蛋白表達水平與患兒術(shù)前SaO2呈負相關(guān)。但是，兩組患兒在HIF-1α mRNA表達水平上沒有顯著差異(p>0.0

6、5)； 2、免疫組化檢測證實在紫紺型先心病患兒心肌細胞胞漿中有大量MIF表達；在紫紺型先心病患兒心肌組織中，MIF基因和蛋白表達均有顯著升高(p<0.001)，表達水平與患兒術(shù)前SaO2呈負相關(guān)(Spearman相關(guān)系數(shù)：-0.74，p<0.01)； 3、Western blot檢測結(jié)果顯示：與非紫紺組相比，紫紺組患兒心肌細胞中AMPK磷酸化水平顯著升高(p<0.001)； 4、體外細胞實驗研究發(fā)現(xiàn)：在正常氧濃度

7、下，MIF mRNA和蛋白也有表達，但是表達水平較低；在缺氧條件下MIF mRNA和蛋白表達水平顯著升高，且升高水平與缺氧的時間相關(guān)。其中，MIF mRNA在缺氧的最初6小時內(nèi)升高最快，6小時左右達到高峰，此后維持在這一高水平；MIF蛋白表達水平在最初24小時內(nèi)持續(xù)增高，在24小時左右達到高峰，此后維持在這一高水平； 5、與對照組心肌細胞相比，慢性缺氧會導(dǎo)致AMPK磷酸化水平的升高，升高程度與缺氧時間相關(guān)：在缺氧的最初3天內(nèi)持續(xù)

8、升高，在缺氧72小時左右，AMPK磷酸化水平和活性程度均達到峰值，此后維持在高水平； 6、檢測缺氧條件下培養(yǎng)的H9c2心肌細胞株的生長情況后發(fā)現(xiàn)，在缺氧開始的24小時內(nèi)細胞的生長較對照組慢(p<0.01)，但是24小時后，缺氧組和對照組細胞在生長率上沒有顯著差異。 結(jié)論： 1、紫紺型患兒心肌組織中HIF-1α蛋白表達增加，蛋白表達量與患兒術(shù)前缺氧程度成正相關(guān)；MIF mRNA和蛋白表達均增加，且與患兒術(shù)前缺氧程度