應(yīng)用基因芯片技術(shù)探索Nrf2介導(dǎo)的乳腺癌阿霉素耐藥機(jī)制初步研究.pdf

1、背景：
　　化療是乳腺癌治療方案的重要組成部分，能夠殺傷或控制體內(nèi)微小腫瘤病灶。乳腺癌對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性是患者腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致治療失敗的主要原因。目前含阿霉素類的化療方案使用廣泛，成為乳腺癌患者術(shù)后輔助化療一線藥物。但臨床上阿霉素類的耐藥現(xiàn)象發(fā)生率相當(dāng)高。據(jù)研究報(bào)道，Nrf2信號(hào)通路與腫瘤耐藥相關(guān)，而Nrf2與乳腺癌阿霉素耐藥的相關(guān)研究較少。因此對(duì)Nrf2與乳腺癌阿霉素耐藥的相關(guān)性進(jìn)行深入研究非常必要。
　　目的：

2、
　　通過Nrf2-siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞株MCF7/ADR，初步研究Nrf2對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性（增殖、凋亡）的影響，并探索Nrf2的表達(dá)水平與乳腺癌阿霉素耐藥相關(guān)性;應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測經(jīng)Nrf2-siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCF-7/ADR細(xì)胞株與對(duì)照組MCF-7/ADR細(xì)胞株之間的基因表達(dá)譜差異，篩選耐藥相關(guān)基因，探討與乳腺癌耐藥相關(guān)的Nrf2潛在下游基因。本研究促進(jìn)對(duì)乳腺癌耐藥機(jī)制的了解，在增加乳腺癌化療敏

3、感性及提高乳腺癌化療療效方面，有較大意義。
　　方法：
　　本研究選擇MCF-7/ADR細(xì)胞株作為研究對(duì)象，經(jīng)Nrf2-RNAi成功穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCF7/ADR細(xì)胞株，沉默Nrf2目的基因表達(dá)。通過熒光顯微鏡下觀察計(jì)算轉(zhuǎn)染效率并應(yīng)用Real timePCR檢測siRNA對(duì)Nrf2 mRNA的干擾效率。成功轉(zhuǎn)染后通過表柔比星（表阿霉素）藥物實(shí)驗(yàn)、MTT法檢測細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡;基因芯片檢測經(jīng)Nrf2-siRNA成功轉(zhuǎn)

4、染后的MCF-7/ADR細(xì)胞株與對(duì)照組細(xì)胞株基因表達(dá)譜的差異，篩選出基因差異倍數(shù)(|FC|)＞1.5倍的差異基因，結(jié)合生物信息學(xué)及基因差異的顯著性，篩選出與乳腺癌細(xì)胞耐藥相關(guān)的基因。并初步探討差異基因在pathway信號(hào)通路的富集及GO分析(Gene Ontology Analysis)。
　　結(jié)果：
　　1、慢病毒成功轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞MCF-7/ ADR細(xì)胞，經(jīng)過穩(wěn)定傳代后，以RT-PCR檢測干擾組與對(duì)照組Nrf2 mRNA相

5、對(duì)表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于陰性對(duì)照組，干擾組中Nrf2基因敲減效率達(dá)到54.3％，符合表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)的要求(p＜0.05);
　　2、表柔比星作用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Nrf2-shRNA的MCF-7/ADR細(xì)胞(KD)及對(duì)照組細(xì)胞株(NC)后，MTT法檢測發(fā)現(xiàn)Nrf2-shRNA轉(zhuǎn)染的MCF-7/ADR細(xì)胞較對(duì)比組細(xì)胞在多個(gè)表柔比星藥物濃度中增殖較為緩慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、接著以流式細(xì)胞儀檢測兩株細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌耐

6、藥細(xì)胞株轉(zhuǎn)染Nrf2-siRNA后，對(duì)表柔比星的耐藥性發(fā)生逆轉(zhuǎn)，對(duì)表柔比星更敏感，轉(zhuǎn)染Nrf2-siRNA后的細(xì)胞株凋亡率更高(P＜0.05)
　　4、通過基因芯片檢測成功敲除目的基因（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Nrf2-shRNA）前后MCF-7/ADR細(xì)胞株差異表達(dá)基因，共篩選出具有差異倍數(shù)(| FC|)＞1.5的基因878個(gè)，涉及多種分子功能，參與多個(gè)生物學(xué)過程。其中表達(dá)上調(diào)的基因341個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因537個(gè)。結(jié)合生物信息學(xué)及基因差異顯著

7、性，篩選出與乳腺癌細(xì)胞耐藥相關(guān)的關(guān)鍵基因，下調(diào)的基因主要包括RAC1、ASNS、NRP1以及SNAI2等，上調(diào)的基因主要為PHLPP2等。
　　結(jié)論：
　　1.本研究結(jié)果表明，通過沉默Nrf2基因表達(dá)，可提高乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞株對(duì)阿霉素的敏感性(P＜0.05)，證實(shí)了Nrf2與乳腺癌阿霉素耐藥性相關(guān)。
　　2.乳腺癌耐藥是一個(gè)及其復(fù)雜的過程，通過基因芯片技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)方法篩選出具有顯著差異性的基因，其中差異較顯