轉(zhuǎn)錄因子Nrf2對阿霉素心臟毒性的影響.pdf

1、目的:隨著腫瘤的發(fā)病率和死亡率不斷劇增，癌癥的治療儼然已成為目前一項重大的公共衛(wèi)生和經(jīng)濟問題。抗腫瘤藥物仍是當前最重要而且極其強大的抗癌工具，但不良反應(yīng)限制其應(yīng)用。如何克服抗腫瘤藥物的不良反應(yīng)成為目前亟待解決的問題。阿霉素(Doxorubicin，DOX)作為蒽環(huán)類代表藥物，廣泛地應(yīng)用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實體瘤，被認為是過去半個世紀最有效的抗腫瘤藥物之一，但嚴重的劑量依賴性心臟毒性限制了其應(yīng)用范圍。關(guān)于DOX心臟毒性的機制尚不完全清

2、楚，近年來越來越多的證據(jù)表明氧化應(yīng)激是DOX心肌病的主要中毒機制，與鐵離子介導(dǎo)的活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化反映出的氧化應(yīng)激的增加以及心肌線粒體DNA的損傷有關(guān)。而近年來的研究發(fā)現(xiàn)，當機體暴露于ROS時，機體自身能誘導(dǎo)出一系列保護性蛋白，以緩解細胞所受的損害。這一協(xié)調(diào)反應(yīng)是由這些保護性基因上游調(diào)節(jié)區(qū)的抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant responsive element，

3、ARE)來調(diào)控的。核因子NF-E2相關(guān)因子(Nuclear factor erythroid2-related factor2，Nrf2)是ARE的激活因子。Nrf2-ARE通路是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，在抗應(yīng)激、抗凋亡、抗炎癥反應(yīng)、抗動脈粥樣硬化以及調(diào)節(jié)心腦血管反應(yīng)、神經(jīng)保護等方面發(fā)揮著廣泛的細胞保護功能，但DOX如何影響Nrf2以及Nrf2在DOX心臟毒性中發(fā)揮著怎樣的作用尚不明確。因此本研究擬采用Nrf2基因

4、敲除小鼠及其誘導(dǎo)劑研究Nrf2/ARE通路是否參與DOX所致的心肌損傷，試圖為DOX心臟毒性的防治提供可靠的實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.基因敲除鼠的鑒定過程:
　　提取鼠尾DNA，采用兩種引物對其基因型進行PCR驗證。
　　2.實驗動物分組、給藥及測定:
　　分別選取健康雄性ICR小鼠40只及基因敲除nrf2小鼠10只用于實驗，將健康雄性ICR小鼠隨機分為4組，基因敲除nrf2小鼠隨機分為2組，共6組，

5、分別為野生型空白對照組(Con-A)、野生型DOX組(DOX-B)、野生型tBHQ組(tBHQ-C)、野生型tBHQ+DOX組(tBHQ-D)、Nrf2基因敲除型空白對照組(Con-E)、Nrf2基因敲除型DOX組(DOX-F)。均采用腹腔注射方式給藥，野生型DOX組和Nrf2基因敲除型DOX組分別一次性給予阿霉素20 mg/kg，對照組給予生理鹽水，野生型tBHQ組(tBHQ-C)給予小鼠腹腔注射tBHQ(25 mg/Kg)，野生型t

6、BHQ+DOX組(tBHQ-D)給予小鼠腹腔注射tBHQ(25mg/Kg)24小時后，再給予阿霉素20 mg/Kg。均采用腹腔注射(i.p.)方法給藥，給藥容積均為0.2 ml/10g。實驗期間每日觀察動物的一般狀況。給予DOX48h后，采用標準肢體Ⅱ?qū)?lián)測量各組大鼠心電圖(ECG)的變化。之后眼眶取血，離心分離上清液測定血清心肌酶譜(CK、CK-MB)，剖開胸腔取心肌組織用于制備組織勻漿測定抗氧化酶MDA的含量，另取部分心室組織固定用

7、于病理學檢查和透射電鏡下觀察組織超微結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果:
　　1.基因敲除nrf2小鼠的鑒定對基因敲除小鼠的DNA進行PCR鑒定的結(jié)果表明Nrf-/小鼠PCR擴增產(chǎn)物的條帶位于400bp左右，而野生型Nrf+/+基因組DNA的PCR擴增產(chǎn)物的條帶位于700bp左右。故可肯定該小鼠基因型正確。
　　2.心電圖的改變兩組空白對照Con-A組和Con-E組之間沒有統(tǒng)計學差異;和Con-A組相比，DOX-B組的ECG表現(xiàn)為ST段

8、明顯抬高，QRS波群和QT間期延長(P均＜0.01），DOX-F組表現(xiàn)得更為明顯(P＜0.05或0.01)。DOX-F組Con-E組、DOX-B組相比ST段明顯抬高(P＜0.05或0.01)，tBHQ-C組表現(xiàn)與Con-A組無明顯差異。tBHQ-D組與Con-A組相比ST段抬高、QRS波群和QT間期延長程度明顯低于DOX-B組(P＜0.05)。
　　3.心肌酶活性測定兩組空白對照Con-A和Con-E之間沒有統(tǒng)計學差異;和Con-

9、A組相比，DOX-B組血清中均升高（P均＜0.01），DOX-F組升高更顯著(P均＜0.01);DOX-F組和Con-E組、DOX-B組相比CK及CK-MB水平均顯著升高(P＜0.05或0.01);tBHQ-C組與Con-A組相比CK及CK-MB水平略有升高，無統(tǒng)計學差異; tBHQ-D組與Con-A相比CK及CK-MB水平升高率明顯低于DOX-B組(P＜0.05或0.01)，tBHQ-D組與DOX-B組相比CK及CK-MB水平顯著降低

10、（P均＜0.01）。
　　4.過氧化產(chǎn)物MDA的測定兩組空白對照Con-A和Con-E之間沒有統(tǒng)計學差異;和Con-A組相比，DOX-B組血清中MDA水平均升高(P＜0.01)，DOX-F組升高更顯著(P＜0.01);DOX-F組和Con-E組、DOX-B組相比MDA水平均顯著升高（P均＜0.01），tBHQ-C組與Con-A組相比MDA水平略有升高，無統(tǒng)計學差異;tBHQ-D組與Con-A組相比MDA水平升高率明顯低于DOX-B

11、組(P＜0.01)。
　　5.心肌組織病理學檢查Con-A組、Con-E組和tBHQ-C組心肌細胞排列整體，未見毛細血管充血、間質(zhì)水腫等現(xiàn)象，而DOX-B組和DOX-F組可見不同程度的毛細血管充血或間質(zhì)水腫現(xiàn)象，以DOX-F組最為嚴重。tBHQ-D組雖仍可見毛細血管充血及水腫等現(xiàn)象，但較DOX-B和DOX-F組明顯減輕。
　　6.心肌組織切片的電鏡觀察Con-A組與Con-E組相比小鼠心肌組織變化無明顯差異，心肌細胞排列整齊

12、，線粒體嵴及基底膜結(jié)構(gòu)正常。而DOX-B組和DOX-F組均可見核一端的基質(zhì)輕度水腫，線粒體、核、糖原數(shù)量減少，部分線粒體輕度受損，大部分嵴和膜融合，模糊不清，線粒體孔化現(xiàn)象，以DOX-F組更為嚴重。tBHQ-C組小鼠與Con-A組比較無明顯異常，tBHQ-D組可見核一端基質(zhì)輕度水腫，線粒體和糖原數(shù)量輕度減少，少部分線粒體嵴和膜融合模糊不清，較DOX-B組和DOX-F組明顯減輕。
　　結(jié)論:
　　1.Nrf2誘導(dǎo)劑tBHQ可減