CARM1在乳腺癌中的表達(dá)及其對MDR1介導(dǎo)的多藥耐藥的調(diào)節(jié).pdf

1、研究背景：
　　浸潤性乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，在全球范圍占女性癌癥的23％。乳腺癌發(fā)病率仍在逐年升高，嚴(yán)重危害世界女性健康?；瘜W(xué)治療是治療乳腺癌的主要手段之一，但是癌細(xì)胞的對化療藥物的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)嚴(yán)重影響化療藥的有效性。多藥耐藥是指在藥物誘導(dǎo)后，腫瘤對一系列結(jié)構(gòu)、靶點(diǎn)和作用機(jī)制不同的藥物均產(chǎn)生了耐藥性。
　　P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是由多藥耐藥

2、基因1(MDR1)編碼，是最重要的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是惡性腫瘤原發(fā)性和繼發(fā)性耐藥的主要原因，與細(xì)胞內(nèi)藥物濃度及耐藥程度密切相關(guān)。目前報(bào)道顯示許多抗腫瘤藥物，包括多柔比星、紫杉醇等均為P-糖蛋白的作用底物。MDR1基因在人體惡性腫瘤中廣泛表達(dá)，約50％的乳腺癌的多藥耐藥與P-糖蛋白的過表達(dá)相關(guān)。即使在低表達(dá)的腫瘤，治療后也可產(chǎn)生P-糖蛋白的高表達(dá)，惡性腫瘤化療后P-糖蛋白表達(dá)率高達(dá)88％。多藥耐藥導(dǎo)致化療失敗、腫瘤轉(zhuǎn)移、患者生存期縮短以及腫瘤

3、治療成本的顯著增加。對于P-gp高表達(dá)的惡性腫瘤，可使用MDR1逆轉(zhuǎn)劑，以提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。目前經(jīng)常應(yīng)用化學(xué)合成的抑制劑以增加腫瘤細(xì)胞的敏感性，但是在達(dá)到有效濃度時也具有較大的毒性。這促使人們更深入地研究MDR1的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　研究表明MDR1的表達(dá)主要由類固醇和異生素受體(steroid and xenobioticreceptor，SXR)的調(diào)節(jié)。SXR是一種細(xì)胞核受體(nuclear receptor，N

4、R)，核受體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用需要和多種共激活因子協(xié)同完成。與相應(yīng)配體結(jié)合后，經(jīng)過一系列復(fù)雜的過程，核受體會募集幾種不同的共激活因子到靶基因的啟動子區(qū)，形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物。共激活因子有的通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用行使功能，能夠促進(jìn)或抑制其它共激活因子或特定的轉(zhuǎn)錄元件的募集;有的可通過酶活性來催化相關(guān)蛋白的翻譯后修飾。在核受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中，翻譯后修飾起著重要的作用，具有酶活性的共激活因子的翻譯后修飾在配體觸發(fā)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中是必不可少的。在

5、SXR對MDR1的調(diào)控中，SXR與相應(yīng)藥物配體結(jié)合后，在p160蛋白家族介導(dǎo)下，激活定位于MDR1基因啟動子的異生素反應(yīng)元件(xenobiotic-response elements，XREs)，啟動MDR1的轉(zhuǎn)錄。在這個過程中，P160共激活因子家族直接與核受體結(jié)合，是募集其他共激活因子的重要支架。但是目前仍不清楚具體還有那些共激活因子參與了SXR對MDR1的轉(zhuǎn)錄激活過程，這尚需深入研究。
　　精氨酸甲基化是一種近年發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄后

6、修飾，由蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(protein argininemethyltransferase，PRMTs)家族催化。在哺乳動物體內(nèi)，迄今共發(fā)現(xiàn)11個PRMTs家族成員;根據(jù)酶催化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，可將PRMTs分為Ⅰ型和Ⅱ型兩大類。Ⅰ型PRMTs(PRMT1，PRMT4， PRMT3和PRMT6)形成非對稱二甲基精氨酸，而Ⅱ型酶催化形成對稱性二甲基精氨酸。PRMT4又稱為共激活相關(guān)精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶1(coactivator-associ

7、ated arginine methyltransferase1，CARM1)，最初是在酵母雙雜交篩選發(fā)現(xiàn)的，是p160共激活因子家族的結(jié)合蛋白。后來研究逐漸發(fā)現(xiàn)CARM1在細(xì)胞內(nèi)具有多方面的功能，特別在控制細(xì)胞周期和生存方面。CARM1能夠甲基化組蛋白和多種非組蛋白，是多種核受體轉(zhuǎn)錄激活的共激活因子，也可以共激活其它多種轉(zhuǎn)錄因子。
　　目前關(guān)于CARM1在惡性腫瘤中的表達(dá)情況的研究并不多，已有報(bào)道CARM1在前列腺癌和大腸癌中高

8、表達(dá)并且與預(yù)后差的指標(biāo)有關(guān)。少數(shù)研究報(bào)道了CARM1在人乳腺癌組織的異常表達(dá)。但是目前的研究存在矛盾之處。El MessaoudiS檢測了81例乳腺癌組織的CARM1mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CARM1在組織學(xué)三級的乳腺癌中顯著升高。但是也有研究表明在ER陽性和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌中，CARM1的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分級之間呈負(fù)相關(guān)性。還有研究報(bào)道CARM1過表達(dá)僅見于少數(shù)乳腺癌患者(27％)。上述研究提示CARM1是一個可能是影響乳腺癌進(jìn)展

9、和預(yù)后的重要因素。然而，這些研究只研究了少數(shù)病例或者只研究CARM1在乳腺癌特殊亞型中的表達(dá)。目前還不清楚CARM1表達(dá)與臨床病理特征，分子分型和預(yù)后之間的關(guān)系。
　　目前雖然已有研究證實(shí)CARM1是許多核受體的共激活因子，例如雌激素受體、雄激素受體、糖皮質(zhì)激素受體和甲狀腺激素受體等，但是還沒有研究證實(shí)CARM1參與了核受體SXR對MDR1的轉(zhuǎn)錄激活過程。SXR對于MDR1的轉(zhuǎn)錄激活過程需要p160蛋白家族參與，而CARM1被證明

10、是p160家族的轉(zhuǎn)錄輔激活因子，p160家族的三個成員都是CARM1的天然底物。綜上所述，CARM1在p160參與的數(shù)種核受體轉(zhuǎn)錄激活中起著重要作用，極有可能參加了SXR對MDR1的調(diào)節(jié)。研究CARM1與SXR和MDR1的相關(guān)性，探討其參與腫瘤多藥耐藥的調(diào)控機(jī)制，或?yàn)槎嗨幠退幠孓D(zhuǎn)提供新的治療靶點(diǎn)。
　　本研究首先應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法，檢測了247未經(jīng)治療的原發(fā)性乳腺浸潤性癌組織中CARM1、ER、PR、HER2、p53、Ki

11、-67指數(shù)和MDR1/P-gp的表達(dá)情況。進(jìn)而檢測了乳腺癌敏感細(xì)胞株MCF-7和多藥耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADM中的CARM1的表達(dá)，結(jié)果表明，在多藥耐藥細(xì)胞中，CARM1 mRNA的水平和蛋白水平均顯著高于敏感細(xì)胞，提示CARM1在MDR1介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的多藥耐藥的過程中可能具有潛在作用。因此，在本研究中設(shè)計(jì)并合成針對CARM1基因的雙鏈干擾RNA序列(siRNA)，將其定向插入到質(zhì)粒載體中，經(jīng)酶切和測序鑒定后，轉(zhuǎn)染至乳腺癌耐藥細(xì)胞

12、株來沉默CARM1表達(dá)，以期下調(diào)MDR1/P-gp的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)MDR1介導(dǎo)的多藥耐藥;同時將含有CARM1全長DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至敏感細(xì)胞株中，觀察CARM1外源性過表達(dá)對MDR1/P-gp的表達(dá)和功能的影響;從而初步探討CARM1參與調(diào)控MDR1的可能的機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶復(fù)合物法Streptavidin-Peroxidasecomplex method)檢測24

13、7例未經(jīng)治療的原發(fā)性乳腺浸潤性癌組織中CARM1、ER、PR、HER2、p53、Ki-67指數(shù)和MDR1的表達(dá)情況，并分析了CARM1的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征、常用分子指標(biāo)和分子亞型之間的關(guān)系，同時分析了CARM1與和MDR1之間的相關(guān)性。
　　2.以本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的乳腺癌敏感細(xì)胞系MCF-7和多藥耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADM為研究對象，用RT-PCR和Western Blot方法分別檢測CARM1及MDR1/P-gp的mRNA和

14、蛋白表達(dá)情況。
　　3.設(shè)計(jì)并合成靶向CARM1基因的雙鏈干擾RNA序列，以和作為陰性對照的非靶向干擾序列，將其定向插入到質(zhì)粒載體pSUPER.neo+GFP中，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的質(zhì)粒載體pSUPER-siCARM1和pSUPER-siNotarget。經(jīng)過限制性內(nèi)切酶切和測序鑒定，確保插入正確后，通過細(xì)菌培養(yǎng)大量擴(kuò)增。
　　4.哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒pSG5.HA-CARM1和pSG5.HA由Michael R.Stallcup教授

15、（美國南加利福尼亞大學(xué)）惠贈.將CARM1全長DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，插入到pEGFP-C1質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒pEGFP-C1-CARM1。經(jīng)過限制性內(nèi)切酶切和測序鑒定，確保插入正確后，通過細(xì)菌培養(yǎng)大量擴(kuò)增。
　　5.分別轉(zhuǎn)染CARM1干擾質(zhì)粒載體和外源性過表達(dá)質(zhì)粒至多藥耐藥細(xì)胞和敏感細(xì)胞中;經(jīng)過48h培養(yǎng)，采用RT-PCR檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中CARM1 mRNA和MDR1mRNA的表達(dá)情況，應(yīng)用Western blot檢測C

16、ARM1蛋白和P-糖蛋白表達(dá)情況，應(yīng)用MTT法檢測各組細(xì)胞對阿霉素的半數(shù)細(xì)胞抑制濃度(IC50)和相對耐藥指數(shù)(RR)的改變，評價(jià)CARM1基因沉默和外源性過表達(dá)后對乳腺癌細(xì)胞的多藥耐藥性的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.免疫組化:CARM1染色可見于細(xì)胞核和細(xì)胞漿。與其周圍良性上皮相比，腺癌的表達(dá)顯著增高。CARM1過表達(dá)與以下指標(biāo)顯著相關(guān):低發(fā)病年齡、較高的組織學(xué)分級、雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)陰性、HER2

17、和p53過表達(dá)、以及高Ki-67指數(shù)。在乳腺癌的分子亞型中，HER2亞型中CARM1表達(dá)率最高(69.6％)，其次是luminal B亞型(59.6％)和TN亞型(57.1％)，luminal A亞型的表達(dá)率最低(41.3％)。在乳腺癌組織中，MDR1/P-gp表達(dá)率為45.7％，CARM1的表達(dá)與MDR1/P-gp表達(dá)呈顯著正相關(guān)。
　　2.對本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的乳腺癌敏感細(xì)胞系和多藥耐藥細(xì)胞系的檢測結(jié)果表明，在多藥耐藥細(xì)胞MCF-7

18、/ADM中，CARM1的mRNA水平和蛋白水平均較敏感細(xì)胞MCF-7顯著升高;MCF-7/ADM細(xì)胞中高表達(dá)MDR1/P-gp，而敏感株MCF-7幾乎不表達(dá)。
　　3.轉(zhuǎn)染后48h，收集細(xì)胞，應(yīng)用半定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染pSUPER-siCARM1的耐藥細(xì)胞中CARM1和MDR1 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示:CARM1干擾組的CARM1及MDR1 mRNA水平均較對照組（轉(zhuǎn)染非靶向性siRNA）明顯降低;Western blo

19、t同樣顯示，CARM1和MDR1/P-gp的蛋白表達(dá)水平在CARM1干擾組細(xì)胞中顯著低于對照組細(xì)胞;MTT法檢測癌細(xì)胞對阿霉素的耐受性，發(fā)現(xiàn)CARM1干擾組細(xì)胞對阿霉素的IC50明顯降低，相對耐藥指數(shù)顯著下降，明顯逆轉(zhuǎn)了癌細(xì)胞的耐藥性。
　　4.轉(zhuǎn)染48h后，應(yīng)用半定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-CARM1的敏感細(xì)胞系MCF-7中CARM1和MDR1 mRNA水平的表達(dá)情況，結(jié)果表明，外源性過表達(dá)CARM1組的CARM1

20、 mRNA和蛋白水平均較對照組均明顯升高，但是MDR1/P-gp的mRNA和蛋白水平無顯著性升高;MTT顯示外源性過表達(dá)CARM1組對阿霉素的耐受性無明顯變化。
　　結(jié)論:
　　1.免疫組化結(jié)果表明，CARM1在乳腺癌組織中的表達(dá)較周圍良性上皮細(xì)胞明顯升高。定位于癌細(xì)胞核的CARM1過表達(dá)與低發(fā)病年齡、多發(fā)性或多中心性腫瘤、高組織學(xué)級別、雌激素和孕激素受體陰性、HER2過表達(dá)、p53過表達(dá)和高Ki-67指數(shù)有關(guān)。CARM1在

21、不同的分子亞型之間表達(dá)水平不同，提示在不同分子亞型中，CARM1可能參與不同的機(jī)制調(diào)節(jié)腫瘤生長。
　　2.在乳腺癌組織中，CARM1蛋白的表達(dá)與MDR1/P-gp的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。在乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥細(xì)胞株中，CARM1與MDR1均呈高表達(dá)，提示CARM1與MDR1介導(dǎo)的獲得性多藥耐藥之間具有相關(guān)性。
　　3.在乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥細(xì)胞株中，干擾CARM1能夠抑制MDR1的表達(dá)，使得癌細(xì)胞的多藥耐藥性顯著降低，從而逆轉(zhuǎn)多藥耐