人ZP4重組子在真核系統(tǒng)中的表達(dá)及線粒體DNA多態(tài)性的調(diào)查.pdf

1、目的:研究目的之一:人類卵膜糖蛋白4(zona pellucidaⅣ，ZP4)基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建、重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)的定位，從而為后續(xù)ZP4與精子結(jié)合的研究提供基礎(chǔ)。研究目的之二:探究中國(guó)北方人群線粒體DNA基因編碼區(qū)多態(tài)性及與帕金森病(Parkinson's disease，PD)的關(guān)聯(lián)性。
　　研究方法:合成含有人ZP4完整編碼區(qū)的DNA，將合成的ZP4基因編碼區(qū)DNA與真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1(+)進(jìn)行重

2、組，同時(shí)重組質(zhì)粒中引入His序列標(biāo)簽。取構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落進(jìn)行培養(yǎng);從大腸桿菌中提取DNA，選擇特異性限制性內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，最后采用DNA測(cè)序方法對(duì)插入序列的完整性及準(zhǔn)確性進(jìn)行鑒定。應(yīng)用質(zhì)粒DNA提取試劑盒分離純化構(gòu)建的pCDNA3.1(+)-ZP4-His重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行體外過(guò)表達(dá)研究;收集分別轉(zhuǎn)染了pCDNA3.1(+)-His和pCDNA3.1(+)-ZP4-His的HEK29

3、3細(xì)胞及對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基，采用免疫印跡技術(shù)(western blot)檢測(cè)過(guò)表達(dá)的重組ZP4蛋白;同時(shí)，研究也對(duì)過(guò)表達(dá)ZP4的HEK293細(xì)胞進(jìn)行固定，采用免疫熒光技術(shù)觀察ZP4在HEK293中的亞細(xì)胞定位。
　　對(duì)于線粒體DNA多態(tài)性的分析，本研究收集了中國(guó)北方地區(qū)353例PD患者和389名健康個(gè)體的血液樣本，采用酚氯仿方法抽提了所有樣本的基因組DNA，應(yīng)用復(fù)合PCR擴(kuò)增和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析方法，對(duì)人類線粒

4、體DNA編碼區(qū)ND1基因上T4216C、ND2基因上A4917G、ND4基因上A11084G、tRNA(L2)基因上A12308G、ND5基因上A13966G、tRNA(Thr)基因上G15928A共6個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行遺傳多態(tài)性調(diào)查，針對(duì)所有位點(diǎn)的頻率數(shù)據(jù)，本研究探討了與PD的潛在相關(guān)性，并且對(duì)性別分層也進(jìn)行了分析。
　　結(jié)果:以合成的人完整編碼區(qū)DNA序列為目的片段，選擇含有His標(biāo)簽序列的真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)，本研究成

5、功構(gòu)建了pCDNA3.1(+)-ZP4-His真核表達(dá)重組質(zhì)粒。為了進(jìn)一步探討構(gòu)建的ZP4重組質(zhì)粒是否能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)，本研究將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后分別收集細(xì)胞及培養(yǎng)基，采用標(biāo)簽抗體和特異性抗體的Western blot分析后，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染人ZP4重組質(zhì)粒的細(xì)胞成功表達(dá)了含有ZP4的融合蛋白，值得一提的是，培養(yǎng)基中也檢測(cè)到了ZP4蛋白，提示重組ZP4蛋白不僅可以有效的在真核細(xì)胞中表達(dá)，而且該蛋白顯示出明顯的外

6、分泌特征。為了進(jìn)一步了解重組ZP4蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位，對(duì)于過(guò)表達(dá)的重組蛋白本研究采用了免疫熒光技術(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，特異性抗體結(jié)合的重組ZP4主要分布在細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，提示為過(guò)表達(dá)的ZP4融合蛋白，但實(shí)驗(yàn)中并未見(jiàn)明顯的細(xì)胞膜分布。此外，相對(duì)于人體卵細(xì)胞的ZP蛋白胞周?chē)植继卣?，本研究中檢測(cè)到的為培養(yǎng)基中存在一定量的分泌，兩種不同分布特性之間的關(guān)聯(lián)需進(jìn)一步研究證明。
　　本研究采用PCR和錯(cuò)配PCR-RFLP方法，復(fù)合擴(kuò)增和酶切結(jié)

7、合，成功地對(duì)人類mtDNA編碼區(qū)上的6個(gè)遺傳多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行了分型;基于得到的各位點(diǎn)的等位基因分型及頻率數(shù)據(jù)，研究也獲得了所有單倍型數(shù)據(jù)。其中，對(duì)性別進(jìn)行分層后，發(fā)現(xiàn)女性群體中A11084G多態(tài)性位點(diǎn)等位基因G的頻率和6個(gè)位點(diǎn)組成的單倍型(4216T-4917A-11084G-12308A-13966A-15928G)的頻率PD組均較對(duì)照組高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而其它位點(diǎn)單倍型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其多態(tài)性分布在中國(guó)北方PD組