人線粒體DNA基因表達(dá)譜芯片的研制及初步應(yīng)用.pdf

1、目的:研制人線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)基因表達(dá)譜芯片，鑒定芯片的特異性和穩(wěn)定性，完善芯片的制備和使用程序，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)，為從事線粒體功能研究的人員提供物質(zhì)基礎(chǔ)及技術(shù)保障。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用所研制的mtDNA基因表達(dá)譜芯片，初步探討順鉑作用下人肺腺癌A549細(xì)胞mtDNA基因差異表達(dá)變化，為進(jìn)一步闡明化療藥物的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:以人mtDNA劍橋序列為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)計(jì)mtDNA編碼的13種mR

2、NA、2種rRNA和9種tRNA基因及核DNA(nDNA)編碼的5種凋亡相關(guān)基因寡核苷酸探針。芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)制芯片，進(jìn)行熒光顯示和洗脫，用其檢測人宮頸癌上皮Hela細(xì)胞和人腎小管上皮Hcl細(xì)胞cDNA文庫mtDNA編碼基因及nDNA編碼凋亡相關(guān)基因的差異表達(dá)情況。再用該芯片檢測0.5μg/ml順鉑誘導(dǎo)A549細(xì)胞20h時(shí)殘存癌細(xì)胞mtDNA表達(dá)基因以及核凋亡相關(guān)基因的差異表達(dá)，并用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。最后，觀察0.5μg/ml順

3、鉑作用24h、48h、72h、96h后殘存癌細(xì)胞mtDNA表達(dá)基因以及核凋亡相關(guān)基因的動態(tài)變化規(guī)律。選擇2個(gè)表達(dá)持續(xù)上調(diào)基因，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timePCR)驗(yàn)證芯片檢測結(jié)果。用GenPixPro4.0芯片圖像分析軟件進(jìn)行基因差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果:1.所點(diǎn)制的芯片掃描結(jié)果顯示，樣點(diǎn)分布均勻、清晰，規(guī)整度好，無漏點(diǎn)、連點(diǎn)。cDNA文庫雜交鑒定結(jié)果顯示，整張芯片熒光信號均勻一致，背景清晰，各基因重復(fù)樣點(diǎn)雜交結(jié)果一

4、致，各質(zhì)控點(diǎn)能正常顯示。 2.順鉑作用20h后殘存A549細(xì)胞mtDNA編碼基因中細(xì)胞色素氧化酶亞單位Ⅰ(CoxⅠ)、核糖體12SrRNA、半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA-Cys)、天冬酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA-Asn)基因表達(dá)顯著上調(diào)。促凋亡基因Bax、細(xì)胞色素氧化酶亞單位Ⅱ(CoxⅡ)、NADH-CoQ還原酶亞單位1(ND1)、NADH-CoQ還原酶亞單位2(ND2)、絲氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA-Ser)、天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(

5、tRNA-Asp)、精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA-Arg)、丙氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA-Ala)基因表達(dá)也有一定程度上調(diào)。其余基因表達(dá)無顯著變化。細(xì)胞凋亡檢測分析提示實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞凋亡率為8.5±0.78％(n=5)，顯著高于對照組1.3±0.56％(n=5)，p=0.03。 3.順鉑誘導(dǎo)A549細(xì)胞時(shí)間動態(tài)觀察結(jié)果顯示，48h后持續(xù)上調(diào)的基因有5個(gè)，分別為tRNA-Asp、ND1、細(xì)胞色素b(Cytb)、核糖體12SrRNA

6、、NADH-CoQ還原酶亞單位4L(ND4L)；間斷性上調(diào)的基因有11個(gè)，分別為谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA-Glu)、tRNA-Arg、組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA-His)、ND2、NADH-CoQ還原酶亞單位3(ND3)、NADH-CoQ還原酶亞單位4(ND4)、NADH-CoQ還原酶亞單位5(ND5)、NADH-CoQ還原酶亞單位6(ND6)、CoxⅠ、細(xì)胞色素氧化酶亞單位Ⅲ(CoxⅢ)、ATP酶亞單位6(ATPase6)；始終無上

7、調(diào)的基因有3個(gè)，分別為CoxⅡ、甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA-Gly)、核糖體16SrRNA。持續(xù)上調(diào)基因表達(dá)水平在72h后趨于平穩(wěn)。持續(xù)上調(diào)基因12SrRNA和Cytb的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果和芯片檢測結(jié)果一致。 結(jié)論1.成功制備了人mtDNA基因表達(dá)譜芯片，完善了該芯片的制備和使用程序，通過初步應(yīng)用，證明所研制的人mtDNA基因表達(dá)譜芯片具有特異性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于不同組織或細(xì)胞樣本cDNA文庫mtDNA基因差異表