骨髓增生異常綜合征基因表達(dá)譜研究及液相診斷芯片的初步建立.pdf

1、目的：骨髓增生異常綜合征(myelodysplasticsyndrome,MDS)是起源于造血干細(xì)胞(hematopoieticstemcells,HSCs)的克隆性髓細(xì)胞造血異常。臨床上以外周血中持續(xù)一個或幾個系列的造血細(xì)胞減少，骨髓造血細(xì)胞發(fā)育異常(dysplasia)或稱病態(tài)造血導(dǎo)致貧血和向急性髓細(xì)胞性白血病轉(zhuǎn)化的高風(fēng)險為基本特征。由于MDS患者的骨髓中細(xì)胞克隆成分呈極端異質(zhì)性，各種細(xì)胞克隆的生物學(xué)表型非常復(fù)雜多樣且處于不斷動態(tài)變

2、化中，而迄今尚未建立真正意義上的MDS細(xì)胞株，因此對MDS細(xì)胞的特性以及MDS的發(fā)病機(jī)理的研究相當(dāng)困難。另外，由于病態(tài)造血累及的造血細(xì)胞系列和嚴(yán)重程度輕重不一,MDS患者的骨髓細(xì)胞成分和臨床表現(xiàn)呈現(xiàn)極大的異質(zhì)性，依賴細(xì)胞形態(tài)、染色體畸變和臨床特征等指標(biāo)來診斷MDS往往相當(dāng)困難，不少病例常難以確診或誤診，需發(fā)展新的分子診斷指標(biāo)。因此，根據(jù)MDS起源于造血干細(xì)胞和病態(tài)造血二大特征，著重從CD34+細(xì)胞全基因組表達(dá)譜芯片上分析與造血和細(xì)胞骨架

3、調(diào)控相關(guān)基因的差異表達(dá)，并通過處于MDS早期階段的MDS-RA病例驗證與MDS病理生理相關(guān)的某些“候選基因”，以深入研究MDS的發(fā)病機(jī)理并期望找到能用于MDS診斷的新分子指標(biāo)，并將新的分子指標(biāo)制成液相表達(dá)芯片以用于MDS的鑒別診斷。研究方法：應(yīng)用Affymetrix全基因組芯片分析研究各階段MDS(難治性貧血(RA)、難治性貧血伴環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞增多(RAS)、難治性貧血伴原始細(xì)胞增多（RAEB）、難治性貧血伴原始細(xì)胞增多轉(zhuǎn)變型(RAEB

4、t))及正常人骨髓CD34+細(xì)胞的基因表達(dá)譜，篩選MDS中與細(xì)胞骨架和造血干細(xì)胞造血調(diào)控密切相關(guān)基因的差異表達(dá)，再用RQ-PCR驗證這些基因在核型正常的MDS-RA病例CD34+細(xì)胞中是否也存在差異表達(dá)，分析差異表達(dá)基因與HSCs造血調(diào)控的內(nèi)在聯(lián)系。由于MDS病例難以獲得足量CD34+細(xì)胞，因此再分析差異表達(dá)基因在核型正常的MDS-RA患者單個核細(xì)胞中的表達(dá)態(tài)勢。選取差異表達(dá)基因與熒光微球偶聯(lián)制成低密度液相表達(dá)陣列，收集臨床病例骨髓標(biāo)本

5、，分成RA組、RAEB組、RAEBt組、急性髓細(xì)胞性白血?。ˋML）組和對照組（包括增生性貧血、缺鐵性貧血、血小板下降、白細(xì)胞下降等），分離單個核細(xì)胞，以管家基因GAPDH為內(nèi)參，與RQ-PCR結(jié)果相比較，分析液相診斷芯片的靈敏度、特異性和重復(fù)性等指標(biāo)及對MDS的鑒別診斷效能。結(jié)果：CD34+細(xì)胞全基因組表達(dá)譜芯片篩得九個表達(dá)發(fā)生趨勢性改變的基因，其中N-cadherin、E-cadherin和c-mycbindingprotein呈下

6、調(diào)趨勢；β-catenin、Rap1GAP、c-mycpromoterbindingprotein、Rac1、Rac2和Cdc42呈上調(diào)趨勢。經(jīng)RQ-PCR驗證，核型正常的MDS-RA病例CD34+細(xì)胞差異表達(dá)基因中，Rap1的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子Rap1GAP顯著上調(diào)(P=0.0001)，其可促使Rap1失活；而與Rap1存在反饋調(diào)節(jié)作用的粘附分子cadherin，包括N-cadherin和E-cadherin，表達(dá)顯著下調(diào)(P=0.0011

7、,P=0.0001)；其下游靶分子β-catenin的表達(dá)顯著增高(P<0.0001)。β-catenin的核內(nèi)靶分子c-myc未檢測出顯著的表達(dá)水平改變(P=0.6859)，但c-mycbindingprotein和c-mycpromoterbindingprotein的表達(dá)水平分別顯著下調(diào)及上調(diào)(P<0.0001,P<0.0001)，兩者分別促進(jìn)和抑制c-myc的表達(dá),推測可能存在負(fù)反饋效應(yīng)，反映c-myc活性具有上調(diào)傾向，這與c-

8、myc在MDS-RA具有相對高的中位值是一致的；既參與造血，又與細(xì)胞形態(tài)密切相關(guān)的RhoGTPases家族分子Rac1、Rac2和Cdc42的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P=0.0007,P=0.0001,P=0.0086)。上述差異表達(dá)基因在核型正常的MDS病例的單個核細(xì)胞中僅Rap1GAP和Rac2存在差異顯著性。選取Rap1GAP、Rac2、SPA1(Rap1的另一個負(fù)調(diào)控分子)、RhoBTB3(與腫瘤密切相關(guān)的RhoGTPases家族分子

9、)和內(nèi)參GAPDH共5個基因建立了液相微球表達(dá)陣列，每個基因檢測的線性范圍為0.0025～0.1umol，液相表達(dá)陣列具有良好的特異性和重復(fù)性(P<0.001)。檢測RA、RAEB、RAEBt、AML和其他組差異表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Rac2、RhoBTB3、SPA-1和Rap1GAP各組間有顯著性差異性存在(分別為P<0.0001,P=0.0491,P=0.0206和P=0.0046)，其差異顯著性與實時熒光定量PCR一致，泊松相關(guān)系數(shù)分別為0.

10、930，0.946，0.945和0.921，具顯著性(P<0.001)。其中Rac2的表達(dá)在RA組與對照組間，RA組與AML組間，RAEB組與AML組存在顯著性差異，以RA組相對表達(dá)水平最高，RAEB組其次，AML組最低；而Rap1GAP的表達(dá)在AML組與其余四組間表達(dá)存在差異性；SPA-1各組間未發(fā)現(xiàn)有顯著性差異存在；RhoBTB3在RAEBt組與其余四組間存在差異，以RAEBt組相對表達(dá)最高。結(jié)論：基于對核型正常的MDS-RA病例C

11、D34+細(xì)胞的基因表達(dá)譜分析，cadherin-β-catenin-c-myc途徑可能對MDS早期造血干細(xì)胞的造血調(diào)控發(fā)揮重要作用，由Rap1GAP負(fù)性調(diào)控的Rap1通過與cadherin的反饋調(diào)節(jié)可能是此信號通路的關(guān)鍵起始分子；Rac2的上調(diào)有助于β-catenin的核內(nèi)轉(zhuǎn)位而增強(qiáng)此信號調(diào)控通路的作用。RhoGTPases家族分子基因的紊亂表達(dá)可能與MDS骨髓細(xì)胞形態(tài)異常相關(guān)。本研究為MDS的病理生理機(jī)制研究提供了新的、重要的出發(fā)點。