應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片篩選盆腔器官脫垂相關(guān)基因的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的： 1.應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片，篩選絕經(jīng)后POP患者與正常絕經(jīng)婦女主韌帶組織中差異表達(dá)的基因2.分析差異表達(dá)基因，探討POP發(fā)生的分子機(jī)制 材料和方法： 1.在絕經(jīng)狀態(tài)、年齡、體重指數(shù)、產(chǎn)次等影響POP發(fā)生的重要因素匹配的前提下，選取3例POP與3例無(wú)POP對(duì)照的子宮主韌帶組織標(biāo)本。 2.組織標(biāo)本行HE染色，Masson's三色染色驗(yàn)證組織來(lái)源，并觀察主韌帶組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。 3.Trizol法提

2、取總RNA，并對(duì)總RNA進(jìn)行定量、質(zhì)檢。采用RNA擴(kuò)增標(biāo)記法合成生物素標(biāo)記的cRNA，與Human Genome U133 Plus 2.0芯片雜交。 4.用SAM軟件篩選｜Score(d)｜≥2，F(xiàn)C值大于2或小于0.5的差異表達(dá)基因。用MAS2.0軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因功能分類(lèi)注釋(GO)和代謝通路分析(Pathway)。 5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證DKK1，SFRP1，F(xiàn)ZD5，WNT16,COL1A1的差異表

3、達(dá)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.標(biāo)本行HE染色、Masson's三色染色觀察，證實(shí)為子宮主韌帶組織。POP組女性子宮主韌帶組織中膠原纖維與平滑肌束失去正常的排列，形態(tài)紊亂，可見(jiàn)膠原纖維斷裂，平滑肌束細(xì)碎。 2.提取總RNA經(jīng)定量和電泳檢測(cè)，質(zhì)量滿足芯片雜交要求。雜交后芯片的各項(xiàng)檢測(cè)參數(shù)均達(dá)到質(zhì)控要求，子宮主韌帶組織與基因表達(dá)譜芯片的雜交模型建立成功。 3.篩選出179個(gè)在POP組和對(duì)照組之間差異表達(dá)的基因。其中包括

4、20個(gè)功能未知的基因。107個(gè)基因在POP組中表達(dá)上調(diào)，72個(gè)基因在POP組中表達(dá)下調(diào)。差異基因涉及多種功能蛋白和代謝通路。其中Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路變化最顯著。 4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR證實(shí)DKK1，SFRP1，F(xiàn)ZD5，WNT16,COL1A1在POP組中表達(dá)明顯升高，與芯片結(jié)果一致。 結(jié)論: 1.POP患者子宮主韌帶組織中膠原纖維與平滑肌束細(xì)碎，排列紊亂。POP中編碼Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型膠原α1鏈蛋白的基因COL1A1、

5、COL3A1、COL5A1的mRNA水平和MMP2的mRNA水平明顯升高，提示POP中膠原合成增加，分解亦增強(qiáng)。說(shuō)明POP中膠原的合成和分解活躍，可能以分解為主，引起韌帶支持結(jié)構(gòu)功能的改變，導(dǎo)致POP發(fā)病。 2.人類(lèi)全基因組表達(dá)譜芯片是一種有效的高通量篩選POP差異表達(dá)基因的研究方法。本實(shí)驗(yàn)以｜Score(d)｜≥2，F(xiàn)C≥2或FC≤0.5為標(biāo)準(zhǔn)篩選出179個(gè)在POP組和對(duì)照組之間差異表達(dá)的基因。其中包括20個(gè)功能未知的基因。1