基于基因表達(dá)譜的肺腺癌治療藥物篩選及相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肺癌是人類(lèi)健康的主要“殺手”,也是我國(guó)男性和女性最主要致死性癌癥之一,包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(發(fā)病率約占80％)。肺腺癌屬于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC),是最常見(jiàn)肺癌之一,發(fā)病率約占原發(fā)性肺癌的20-30％,在許多國(guó)家已超過(guò)鱗狀細(xì)胞癌。目前,臨床采用外科治療、放射治療、化學(xué)治療等多種方法綜合治療NSCLC。近年來(lái),NSCLC的治療雖獲得較為快速的進(jìn)展,但NSCLC的預(yù)后及治療仍不理想,包括肺腺癌在內(nèi)的各類(lèi)肺癌總體的5年生存率仍非常低

2、(15％以?xún)?nèi))。因此,發(fā)現(xiàn)新的高效低毒的治療藥物,對(duì)延長(zhǎng)病人的生存期及降低肺腺癌等肺癌的死亡率有著重要意義。
　　 綜上,由于肺腺癌屬于最常見(jiàn)的肺癌類(lèi)型,嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康,因此,尋找一些高效、低毒的肺腺癌治療藥物有著迫切的臨床需要。本研究將利用基于基因表達(dá)譜的藥物發(fā)現(xiàn)模式,通過(guò)計(jì)算生物學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)分析策略“connectivity map”篩選肺腺癌治療候選化合物或藥物,并進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究將為肺腺癌的治療藥物發(fā)現(xiàn)和臨

3、床治療提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù),同時(shí)也加速肺腺癌藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程。
　　 本研究?jī)?nèi)容主要分為三個(gè)部分:
　　 第一部分 基于基因表達(dá)譜的肺腺癌治療藥物篩選
　　 目的:探討基于基因表達(dá)譜的藥物發(fā)現(xiàn)途徑在肺腺癌治療藥物篩選中的應(yīng)用價(jià)值,篩選和發(fā)現(xiàn)新的肺腺癌治療藥物。
　　 方法與結(jié)果:
　　 1.從GEO中獲取肺腺癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集:通過(guò)Ftp工具,從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得兩個(gè)肺腺癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集,即

4、GSE7670和GSE10072,其中,GSE7670數(shù)據(jù)集來(lái)源于臺(tái)灣臺(tái)北榮民總醫(yī)院,共64個(gè)樣本； GSE10072來(lái)源于美國(guó)N.I.H遺傳流行病學(xué)部,共107個(gè)樣本,兩數(shù)據(jù)集均采用GPL96芯片平臺(tái)。為提高生物信息學(xué)分析的質(zhì)量,我們首先采用RMAexpress軟件對(duì)芯片樣本進(jìn)行了質(zhì)量分析,刪除偏差大的樣本數(shù)據(jù)。最后,從GSE7670獲得36個(gè)樣本,包括16個(gè)肺腺癌樣本和20個(gè)癌旁正常樣本；從GSE10072中獲得43個(gè)樣本,包括20

5、肺腺癌樣本和23個(gè)癌旁正常樣本。
　　 2.肺腺癌差異表達(dá)基因分析 為了獲得肺腺癌共同差異基因表達(dá)譜,我們采用BRB軟件分別對(duì)GSE10072和GSE7670數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因差異表達(dá)分析,最終通過(guò)Venny作圖工具獲得共同差異表達(dá)基因344個(gè),其中上調(diào)基因93個(gè),下調(diào)基因251個(gè)(Fold change>2)。
　　 3.Cmap篩選肺腺癌治療藥物 首先,我們建立肺腺癌gene query signature文件,然后通過(guò)

6、cMAP在線(xiàn)分析工具進(jìn)行肺腺癌候選藥物篩選,結(jié)果表明,熱休克90抑制劑(tanespimycin,monorden,alvespimycin,geldanamycin)、HDAC抑制劑(trichostatin A,vorinostat)、PPAR受體激動(dòng)劑(15-delta prostaglandin J2,troglitazone,pioglitazone,bufexamac)與PI3K抑制劑(LY-294002)等4類(lèi)藥物負(fù)性富集

7、分?jǐn)?shù)較高,可較好的逆轉(zhuǎn)肺腺癌基因表達(dá)譜,提示這些藥物可能成為肺腺癌治療候選藥物。
　　 結(jié)論:基于基因表達(dá)譜的藥物發(fā)現(xiàn)途徑應(yīng)用于肺腺癌治療候選藥物發(fā)現(xiàn)是可行的。通過(guò)本研究篩選到一些肺腺癌候選治療藥物,為下一步實(shí)驗(yàn)研究提供理想的候選藥物或化合物,加速了藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程。
　　 第二部分 17-AAG對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的增殖抑制作用
　　 目的:在第一部分,我們篩選到多類(lèi)肺腺癌治療候選化合物,特別是多種Hsp90抑制劑

8、(如tanespimycin(17-AAG),monorden,alvespimycin及geldanamycin等)被篩選到,其中17-AAG負(fù)性富集分?jǐn)?shù)最高,它是格爾德霉素衍生物,目前正在進(jìn)行臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗(yàn)。本部分主要觀察17-AAG對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的增殖抑制作用,并觀察17-AAG對(duì)A549細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。
　　 方法與結(jié)果:
　　 1.17-AAG對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的增殖抑制作用:采用MTT法測(cè)

9、定17-AAG對(duì)A549的增殖抑制作用,實(shí)驗(yàn)分不同濃度17-AAG組(0.2、0.4、0.8、1.6及3.2 μM)、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組,藥物處理時(shí)間為24h、36 h、48h。結(jié)果顯示:不同的劑量組對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=586.02,P=0.000)；同一劑量3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=116.262,P=0.000)；劑量與時(shí)間占之間有交互效應(yīng)(F=18.789,P=0.000)。17-AAG作用24

10、h、36h及48h時(shí),其半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為1.539、0.884和0.455μM,提示17-AAG對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴(lài)性。
　　 2.17-AAG對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯作用:通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)分析各種濃度17-AAG作用A54924h后細(xì)胞周期的變化,結(jié)果表明:0.11μM、0.23μM及0.45μM劑量組G2/M期細(xì)胞比例分別為(12.93±0.29)％、(20.57±0.29)％和(23

11、.00±3.64)％,與對(duì)照組(6.03±0.95％)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001),但0.23μM和0.45μM兩劑量組之間無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　 3.17-AAG對(duì)A549細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用 不同劑量17-AAG作用A54924h后,通過(guò)Annexin-Ⅴ和PI雙染法檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果表明,17-AAG可誘導(dǎo)A549發(fā)生凋亡,其凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)與劑量有關(guān)。與陰性對(duì)照相比,0.11μM17-AAG組早期

12、凋亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；0.23μM 17-AAG組晚期凋亡率(11.86±0.951％)高于對(duì)照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),但早期凋亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05):0.45μM 17-AAG組早期凋亡率(9.35±0.547％)和晚期凋亡率(21.316±1.036％)均高于對(duì)照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.005)。與低、中劑量組相比,0.45μM 17-AAG組早期和晚期凋亡率均明顯增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.00

13、5)。
　　 結(jié)論:17-AAG抑制A549細(xì)胞增殖,引起A549細(xì)胞在G2/M期產(chǎn)生阻滯,并誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡.
　　 第三部分 17-AAG協(xié)同順鉑抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖
　　 目的:順鉑是治療非小細(xì)胞肺癌最為常用的基礎(chǔ)化療藥物,但單用具有副作用多、毒性大及產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn),故尋找高效低毒的順鉑增敏劑有重要臨床意義。我們的研究表明,17-AAG可有效的抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖,導(dǎo)致細(xì)胞周期G2/M阻滯,并誘

14、導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡,本部分將探討17-AAG與順鉑的聯(lián)用是否產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),為17-AAG治療肺腺癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法與結(jié)果:
　　 1.MTT法檢測(cè)17-AAG聯(lián)合順鉑對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用。實(shí)驗(yàn)分:對(duì)照組、各種劑量順鉑組(4.4,8.7,17.5,35及70μM)、不同劑量17-AAG組(0.025,0.05,0.1,0.2及0.41μM)和上述各濃度兩藥物聯(lián)合組(17-AAG+順鉑組),A549細(xì)胞分別與

15、各種藥物孵育48h。應(yīng)用中效原理對(duì)17-AAG和順鉑聯(lián)合用藥作用進(jìn)行評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)17-AAG和順鉑聯(lián)合可產(chǎn)生良好協(xié)同抑制效應(yīng),合用時(shí)中效濃度及各自所需用量均比單用時(shí)要小:順鉑單用時(shí)Dm為69.627μM,合用時(shí)Dm為16.19μM,合用時(shí)比單用時(shí)小4.3倍；而17-AAG單用時(shí)Dm為0.4547μM,合用時(shí)Dm為0.093μM,合用時(shí)比單用時(shí)小4.89倍。按中效原理,我們得出17-AAG與順鉑兩藥合用的效應(yīng)與合用指數(shù)關(guān)系,隨著兩藥劑量的增

16、加,其效應(yīng)fa和CI也相應(yīng)增加,當(dāng)效應(yīng)fa>0.8時(shí),兩藥合用指數(shù)CI>1,產(chǎn)生拮抗效應(yīng)；fa<0.8時(shí),CI<1,兩藥合用產(chǎn)生協(xié)同作用,即17-AAG<1.24μmol/L與順鉑<217μmol/L的劑量聯(lián)合用藥時(shí),可產(chǎn)生協(xié)同作用。
　　 2.17-AAG與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞周期影響 A549細(xì)胞分別經(jīng)各劑量17-AAG(0.12μM,0,23μM或0.45μM)+70μM ciplatin處理24h之后,采用流式細(xì)胞技術(shù)分析

17、17-AAG與順鉑聯(lián)合應(yīng)用之后細(xì)胞周期變化。結(jié)果表明:當(dāng)17-AAG與順鉑聯(lián)合作用后,與對(duì)照組相比較,細(xì)胞周期G1期和G2/M期細(xì)胞比率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),僅在0.45 μmol/L 17-AAG與70μmol/的順鉑聯(lián)用時(shí),發(fā)現(xiàn)S期細(xì)胞比率增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 3.17-AAG與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞凋亡影響 A549細(xì)胞經(jīng)17-AAG或順鉑或17-AAG+順鉑處理24h之后,通過(guò)Annexin Ⅴ

18、-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化。結(jié)果表明:各藥物組之間早期凋亡率(F=97.60,P=0.000)和晚期凋亡率(F=645.01,P=0.000)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與順鉑單劑量用藥相比,低劑量(0.12μM)17-AAG與順鉑合用其早及晚期凋亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),但17-AAG在較大劑量下與順鉑聯(lián)用后,早及晚期凋亡率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.005),尤其是壞死細(xì)胞和晚期凋亡率統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.001)。