基因表達(dá)譜芯片法篩選人體肺腺癌干細(xì)胞特異性標(biāo)志及其鑒定.pdf

1、背景與目的: WHO統(tǒng)計(jì)顯示腫瘤患者中肺癌發(fā)病率在男性排第一，女性排第二。肺癌5年生存率平均為9％-13％，即使是早期手術(shù)患者，5年的生存率也僅在18％左右。肺腺癌在肺癌中的比例上升速度很快，已成為肺癌的主要病理類(lèi)型，其發(fā)病率占肺癌總數(shù)的30％～40％。肺腺癌的復(fù)發(fā)率高，容易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，目前的治療方法不能令人滿(mǎn)意。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為腫瘤起源于腫瘤內(nèi)的腫瘤干細(xì)胞，這些細(xì)胞具有自我更新能力和多向分化的潛能，是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源

2、，也是腫瘤對(duì)化療和放療不敏感的原因。Eramo等人于2007年鑒定了人肺癌干細(xì)胞，為肺腺癌干細(xì)胞的研究起到了積極地推動(dòng)作用。正常肺干細(xì)胞是如何轉(zhuǎn)換為肺腺癌干細(xì)胞的？肺腺癌干細(xì)胞具有怎樣特異性的標(biāo)志？這些問(wèn)題的解決對(duì)肺腺癌的發(fā)病機(jī)理、早期診斷和治療具有重要意義。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)：分離并鑒定肺腺癌干細(xì)胞，通過(guò)基因表達(dá)譜分析建立肺腺癌干細(xì)胞特異性表達(dá)譜，通過(guò)生物信息學(xué)篩選適宜的肺腺癌干細(xì)胞特異性標(biāo)志并進(jìn)行鑒定。 方法:

3、 第一部分人體肺腺癌干細(xì)胞的分離和鑒定： 1.肺腺癌和正常肺組織干細(xì)胞的分布：CD133-PE和CD326-FITC雙標(biāo)記免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡檢查； 2.干細(xì)胞的分離：采用磁珠分選法，將制備的單細(xì)胞懸液用CD133-PE標(biāo)記，磁珠分選系統(tǒng)分選細(xì)胞，熒光顯微鏡下檢測(cè)分離細(xì)胞的純度； 3.肺腺癌干細(xì)胞的培養(yǎng)：在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每3天半量換液，觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)； 4.肺腺癌干細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：在96孔板中

4、培養(yǎng)干細(xì)胞，WST法測(cè)定細(xì)胞增殖水平，第0，4，6，8，天測(cè)定OD450值，繪制增殖曲線(xiàn)圖； 5.成瘤實(shí)驗(yàn)：4周齡NOD/SCID小鼠15只，隨機(jī)分為A、B、C3組，每組5只。每只NOD/SCID小鼠近右后肢皮下接種分選的CD133+細(xì)胞，近左后肢皮下接種分選的CD133-細(xì)胞；A、B、C組右側(cè)分別接種1×102個(gè)、1×103個(gè)、1×104個(gè)CD133+細(xì)胞，左側(cè)分別接種1×104個(gè)、1×105、1×106個(gè)CD133-細(xì)胞，觀(guān)

5、察8周。 第二部分基因表達(dá)譜分析人體肺腺癌干細(xì)胞與正常肺干細(xì)胞的差異基因表達(dá) 1.流式細(xì)胞術(shù)分選干細(xì)胞：將制備的單細(xì)胞懸液用CD133-PE和CD326-FITC雙標(biāo)記，用空白管和同型對(duì)照管設(shè)分選區(qū)域，分選下來(lái)的細(xì)胞留少部分熒光顯微鏡觀(guān)察，其余用于表達(dá)譜芯片檢測(cè)； 2.表達(dá)譜芯片檢測(cè)：將分選的細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，Cy3標(biāo)記，雜交，熒光掃描，軟件分析差異基因的表達(dá)； 3.差異表達(dá)譜的分析：對(duì)差異表達(dá)的

6、基因進(jìn)行GO和pathway分析，對(duì)分析結(jié)果分類(lèi)總結(jié)，重點(diǎn)分析原癌基因改變、wnt信號(hào)通路改變； 4.qRT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果：挑選表達(dá)上調(diào)的Rab25、TLE2和表達(dá)下調(diào)的FGR、MACF1進(jìn)行qRT-PCR，比較qRT-PCR法和表達(dá)譜芯片法中各基因的改變倍數(shù)，進(jìn)行t檢驗(yàn)。 第三部分人體肺腺癌干細(xì)胞特異性標(biāo)志的篩選和鑒定 1.候選靶位Rab25、TLE2、LRP5和PYG02的生物信息學(xué)分析：通過(guò)查詢(xún)NCB

7、IGENBANK、SWISSPROT/TrEMBL、GO、KEGG、Blastp、Protscale等數(shù)據(jù)庫(kù)，分析候選靶位分子的m RNA長(zhǎng)度、蛋白長(zhǎng)度、染色體定位、分子量、GO分類(lèi)、信號(hào)通路、疏水區(qū)、同源序列等信息。 2.Rab25在肺腺癌和正常肺干細(xì)胞中的表達(dá)：通過(guò)候選靶位蛋白的生物信息學(xué)分析，我們選擇Rab25作為肺腺癌干細(xì)胞的特異性靶位(Rab25屬于RAS超家族成員，具有小GTPase活性)，通過(guò)CD133-PE和Ra

8、b25(二抗為FITC標(biāo)記)雙標(biāo)法檢測(cè)Rab25在肺腺癌組織和正常肺組織干細(xì)胞中的表達(dá)； 3.Rab25單抗對(duì)肺腺癌干細(xì)胞增殖能力的影響：在肺腺癌干細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中加入不同濃度的Rab25抗體，檢測(cè)干細(xì)胞增殖活性。 結(jié)果: 第一部分人體肺腺癌干細(xì)胞的分離和鑒定： 1.肺腺癌和正常肺組織干細(xì)胞的分布：組織中有少量干細(xì)胞，正常組織中分布于BADJ(支氣管肺泡連接處)，腺癌組織中分布于肺泡壁和BADJ。

9、2.干細(xì)胞的分離：分離到的干細(xì)胞純度在60％-70％，熒光顯微鏡具有典型干細(xì)胞形態(tài)。 3.肺腺癌干細(xì)胞的培養(yǎng)：培養(yǎng)第6天細(xì)胞呈團(tuán)，第20天可見(jiàn)典型細(xì)胞球。 4.肺腺癌干細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞增殖明顯，增殖能力強(qiáng)。 5.成瘤實(shí)驗(yàn)：1×104個(gè)CD133+細(xì)胞組一只小鼠成瘤，其余組未成瘤。 第二部分基因表達(dá)譜分析人體肺腺癌干細(xì)胞與正常肺干細(xì)胞的差異基因表達(dá) 1.流式細(xì)胞術(shù)分選干細(xì)胞：正常組織中CD133+

10、CD326+雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例為0.31％，共分選了約5×107個(gè)細(xì)胞，得到雙陽(yáng)性細(xì)胞約1×105個(gè)；肺癌組織中CD133+CD326+雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例為0.65％，共分選了約7×107個(gè)細(xì)胞，得到雙陽(yáng)性細(xì)胞約4×105個(gè)。 2.表達(dá)譜芯片檢測(cè)：提取的RNA經(jīng)甲醛變性凝膠電泳顯示無(wú)降解，純度高，標(biāo)記后肺腺癌干細(xì)胞和正常肺干細(xì)胞的特異性活性分別為21.8和26.9pmolCy3/μgcRNA，標(biāo)記產(chǎn)物總量分別為13.98和13.9μ

11、g；應(yīng)用Agilent4 x44K人全基因組芯片進(jìn)行雜交分析，LCSC與LSC的差異表達(dá)基因?yàn)?798個(gè)(cut-off值為2.0)。 3.差異表達(dá)譜的分析：基因分層聚類(lèi)顯示兩種干細(xì)胞具有明顯不同的表達(dá)譜。GO分析顯示在生物過(guò)程中，生物調(diào)節(jié)相關(guān)的差異表達(dá)基因占41％，其他比例較高的涉及細(xì)胞組分形成和發(fā)生、胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期等基因。在分子功能中，我們發(fā)現(xiàn)，72％的差異表達(dá)基因與結(jié)合有關(guān)，主要為蛋白結(jié)合(45％)、

12、核酸結(jié)合(15％)、AI結(jié)合(10％)和鈣離子結(jié)合(6％)等。其他比例較高的包括轉(zhuǎn)移酶活性、激酶活性和酶調(diào)節(jié)活性。在細(xì)胞組分方面，包膜占13％，其他為非膜結(jié)合細(xì)胞器、胞外區(qū)、細(xì)胞組分、大分子復(fù)合物成分。Pathway分析顯示wnt信號(hào)通路差異顯著(p<0.01)，在差異表達(dá)的基因中共有13個(gè)參與wnt通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，原癌基因分析顯示共有11個(gè)原癌基因的表達(dá)發(fā)生了差異性改變。 4.q RT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果：FGR表達(dá)下調(diào)7.2倍

13、，RAB25上調(diào)20倍，TLE2表達(dá)上調(diào)15倍，MACF1下調(diào)1.8倍。表達(dá)譜芯片和q RT-PCR兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，p>0.05，兩種方法無(wú)顯著差異。 第三部分人體肺腺癌干細(xì)胞特異性標(biāo)志的篩選和鑒定 1.候選靶位Rab25、TLE2、LRP5和PYGO2的生物信息學(xué)分析：通過(guò)查詢(xún)NCBIGENBANK、SWISSROT/TrEMBL、GO、KEGG、Blastp、Protscale等數(shù)據(jù)庫(kù)，我們得到了候選抗原的m R

14、NA長(zhǎng)度、蛋白長(zhǎng)度、染色體定位、分子量、GO分類(lèi)、信號(hào)通路、疏水區(qū)、同源序列等信息。 2.免疫熒光鑒定Rab25在組織切片中肺腺癌干細(xì)胞的特異性表達(dá)：肺腺癌切片中可見(jiàn)明顯雙陽(yáng)性細(xì)胞胞膜為黃色，胞漿部分綠色，證實(shí)Rab25在肺腺癌干細(xì)胞胞膜和胞漿均表達(dá)，主要表達(dá)在胞膜；正常肺組織干細(xì)胞胞膜紅色，胞漿不著色，表明其基本不表達(dá)Rab25。 3.Rab25對(duì)肺腺癌干細(xì)胞增殖的影響：Rab25抗體可明顯抑制肺腺癌干細(xì)胞的增殖(p<

15、0.05)，抑制效應(yīng)與濃度呈量效關(guān)系。 結(jié)論: 1.肺腺癌和正常肺組織存在少量干細(xì)胞，正常組織中分布于BADJ處，腺癌組織中分布于肺泡壁和BADJ。 2.分離的肺腺癌干細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力和致瘤能力。 3.肺正常組織中干細(xì)胞比例為0.31％，肺腺癌組織中干細(xì)胞比例為0.65％。 4.基因分層聚類(lèi)顯示兩種干細(xì)胞具有明顯不同的表達(dá)譜。在生物過(guò)程中，生物調(diào)節(jié)相關(guān)的差異表達(dá)基因占41％；在分子功能中，結(jié)