條件性基因敲除鼠肺腺癌干細胞的分離、鑒定及其microRNA表達譜的初步研究.pdf

1、肺癌是威脅人類健康的最常見惡性腫瘤。目前,肺癌早期診斷技術的提高和以手術、化療和放療為主的綜合治療方法取得了較大的進步,但肺癌總的5年生存率仍不足15％。近年來的研究表明,腫瘤是一種干細胞疾病,在腫瘤組織中存在少量癌干細胞。腫瘤干細胞是一群稀少的未分化的腫瘤細胞,具有無限增殖和自我更新的能力,能夠產(chǎn)生大量分化細胞的前體細胞,最終形成腫瘤?，F(xiàn)已經(jīng)從多種腫瘤組織中成功分離出癌干細胞,包括白血病、黑素瘤、腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和腸

2、癌等。這些細胞具有無限的增殖能力、自我更新能力和分化能力,是腫瘤發(fā)生的根源。因此,探索癌干細胞的調(diào)控機制和尋找癌干細胞特異性分子,將為腫瘤的診斷和治療提供有效的靶點。
　　 為了驗證肺腺癌干細胞及其特征性miRNAs在肺腺癌發(fā)生中的重要作用,我們擬從肺腺癌干細胞入手,首先,建立條件性基因敲除小鼠肺腺癌模型;流式細胞儀分選肺腺癌干細胞;肺腺癌干細胞的培養(yǎng)以及鑒定;微陣列技術檢測在肺腺癌形成過程的不同時期肺癌干細胞miRNAs表達情

3、況,并應用實時定量熒光PCR技術(quantitativereal-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)進行驗證:生物信息學初步預測所選miRNAs的功能及其作用靶點。本研究以小鼠肺腺癌干細胞的分離、鑒定為基礎,以尋找在小鼠肺腺癌形成過程中肺腺癌干細胞的特征性miRNAs為突破點,研究小鼠正常肺干細胞惡性突變?yōu)榉蜗侔└杉毎姆肿訖C制,不僅鑒定了正常小鼠肺干細胞向肺腺癌干細胞突變過程中的miRNA

4、s表達譜,而且為后續(xù)深入探討miRNAs調(diào)控干細胞自我更新和分化作用以及肺干細胞向肺癌干細胞轉變的分子機制奠定了基礎。
　　 目的:
　　 腺病毒AdCre的大量擴增后,腺病毒AdCre誘導條件性基因敲除鼠Lox-stop-loxK-ras G12D小鼠肺腺癌模型的建立;根據(jù)表面標記肺干細胞的CD45-CD3rSca-1+CD34+流式細胞儀分選出腺病毒AdCre誘導后Lox-stop-lox K-rasG12D小鼠肺腺

5、癌模型中的陽性細胞,并驗證其是否具有癌干細胞特性;微陣列技術檢測BASCs和肺腺癌模型中CD45-CD31-Sca-1+CD34+細胞的miRNAs表達情況,比較二者miRNAs表達差異,并應用實時定量熒光PCR技術(quantitative real-timepolymerase chain reaction,qRT-PCR)進行驗證:生物信息學初步預測所選miRNAs的功能及其作用靶點。生物信息學初步預測let-7a-2的相關靶基因

6、,Lenti-1et-7a-2轉染A549細胞,以腫瘤qRT-PCR凋亡相關芯片尋找Lenti-let-7a-2改變的凋亡相關基因。
　　 方法:
　　 1.Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠肺腺癌模型的建立:腺病毒AdCre的大量擴增后,以戊巴比妥鈉腹腔麻醉Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠后,分別于鼻腔吸入腺病毒AdCre后15天、30天后,取小鼠全部肺組織進行病理切片檢測肺部腫瘤細胞

7、的生長情況。
　　 2.小鼠肺腺癌干細胞的分選和培養(yǎng)鑒定:取腺病毒AdCre誘導不同時期的Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠全肺組織。采用膠原酶和分散酶聯(lián)合消化小鼠肺組織制備肺單細胞懸液,通過流式細胞儀分選CD45-CD31-Sca-1+CD34+細胞,并將其培養(yǎng)于含有bFGF、EGF和ITS的無血清培養(yǎng)基,體外培養(yǎng)檢測CD45-CD31-Sca-1+CD34+細胞自我更新能力、分化能力,體內(nèi)成瘤實驗檢測其致瘤能

8、力。
　　 3.Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠肺腺癌不同時期miRNAs表達譜的鑒定:經(jīng)腺病毒AdCre誘導15天、30天的Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠全部肺部組織分別制備為單細胞懸液,流式細胞儀進行分選,分選出的細胞常規(guī)提取RNA后,經(jīng)YM-100(Millipore)微離心過濾柱抽提小于300核苷酸長度的小RNA;微陣列法檢測肺腺癌形成的過程中不同時期肺腺癌干細胞和其對照細胞(未經(jīng)腺

9、病毒AdCre誘導的Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠肺干細胞)的miRNAs表達譜,篩選出差異miRNAs;構建miRNAs特異性探針,qRT-PCR法驗證所選差異miRNAs在兩種細胞的表達;生物信息學初步預測被選miRNAs的功能及其作用靶點。
　　 4.將Lenti-let-7a-2轉染A549細胞,挑選穩(wěn)定轉染Lenti-let-7a-2的A549細胞和未轉染Lenti-let-7a-2的A549細胞進

10、行qRT-PCR凋亡相關芯片檢測,結合生物信息學的靶基因預測,篩選出let-7a-2與腫瘤凋亡相關的基因變化。
　　 結果:
　　 1.成功建立Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠肺腺癌模型:腺病毒AdCre擴增、滴度測定后,給Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠鼻腔吸入腺病毒AdCre后分別15天后,小鼠肺組織外觀未見改變,但顯微環(huán)境下支氣管、細支氣管粘膜變厚,粘膜下層有異型性細胞聚集;30

11、天后小鼠肺組織表面許多突起的瘤體組織,小鼠全部肺組織都不同程度呈現(xiàn)癌變,肺組織可見多處癌巢。
　　 2.流式細胞儀分選小鼠肺腺癌模型中的CD45-CD31-Sca-1+CD34+細胞,在體外無血清培養(yǎng)體系中,CD45-CD31-Sca-1+CD34+細胞可以生長為非貼壁的、多細胞的細胞球。在含有血清的培養(yǎng)基中,CD45-CD31-Sca-1+CD34+細胞可以分化為其他細胞。體內(nèi)的成瘤實驗表明,CD45-CD31-Sca-1+C

12、D34+細胞的致瘤能力是肺腺癌模型肺組織單細胞的25倍以上。以上均說明小鼠肺腺癌動物模型中的CD45-CD31-Sca-1+CD34+細胞具有癌干細胞的特性。
　　 3.肺腺癌形成過程中不同時期(腺病毒AdCre誘導前、腺病毒AdCre誘導后15天、腺病毒AdCre誘導后30天)CD45-CD31-Sca-1+CD34+細胞的分選及其miRNAs表達譜差異:通過膠原酶和分散酶聯(lián)合消化小鼠肺組織,平均每只成年小鼠可得到有核細胞總數(shù)

13、為1.6～1.8×107;流式細胞儀檢測CD45-CD31-Sca-1+CD34+細胞占肺細胞總數(shù)的0.7％～1.1％。微陣列法檢測miRNAs的表達并比較差異,背景值經(jīng)過標準化后,比較三組細胞共發(fā)現(xiàn)依次增高的microRNA分子有145個、依次降低的microRNA分子有72個(P＜0.01);其中有13個miRNAs在腺病毒AdCre誘導后的動物模型中高表達,67個miRNAs在腺病毒AdCre誘導后的動物模型中低表達;三組樣本之間

14、有依次遞增或者遞減的分子,特別是他們之間差異巨大的分子,根據(jù)對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析,mmu-miR-15a*、mmu-miR-203、mmu-miR-294、mmu-miR-295*在三組樣本中依次遞增約1.2倍;mmu-miR-19b、mmu-miR-483、mmu-miR-615-5p依次遞減約0.5倍。通過qRT-PCR法檢測這7個分子在三個不同樣本中的差異,RT-PCR的檢測結果與miRNAs芯片檢測結果一致。生物信息學初步分析所選差

15、異miRNAs的作用靶點和功能。
　　 4.通過targetscn及pictar在線軟件生物信息學分析,let-7a定位于11號染色體的122017230-122017301[-],通過預測let-7a的保守性靶點為HMGA2等819個分子,其中包括FASLG;穩(wěn)定轉染Lenti-let-7a-2的A549細胞腫瘤qRT-PCR凋亡相關芯片與未轉染Lenti-let-7a-2的A549細胞比較提示BCLAF1等14分子的2^-△

16、Ct值增高,BCL2A1、FASLG、TNF等16個分子的2^-△Ct值降低;作為穩(wěn)定表達let-7a分子的A549,更關心芯片中表達降低的分子,結合生物信息學分析,確定表達降低分子中FASLG為let-7a的靶分子。
　　 結論
　　 1.成功建立Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠肺腺癌模型。在條件性基因敲除小鼠肺腺癌動物模型鼠中,CD45-CD31-Sea-1+CD34+細胞具有癌干細胞的特性。

17、>　　 2.通過微陣列法鑒定了肺腺癌形成過程中不同時期CD45-CD31-Sca-1+CD34+細胞的miRNAs譜,通過對比發(fā)現(xiàn)其中有13個miRNAs在腺病毒AdCre誘導后的動物模型中高表達,67個miRNAs在腺病毒AdCre誘導后的動物模型中低表達,mmu-miR-15a*、mmu-miR-203、mmu-miR-294、mmu-miR-295*在三組樣本中依次遞增約1.2倍,mmu-miR-19b、mmu-miR-483、