SD鼠心肌干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其鑒定.pdf

1、背景:干細(xì)胞定向分化心肌細(xì)胞替代治療冠心病是近年冠心病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。Orlic[1]等人于2001年發(fā)表于Nature上的關(guān)于Lin-c-kit+造血干細(xì)胞再生心肌細(xì)胞的研究引起了學(xué)界的廣泛關(guān)注，促使許多相關(guān)基礎(chǔ)研究乃至一些小規(guī)模臨床試驗(yàn)的開展，意義非凡。但2004年Balsam[2]和Murry[3]的研究得出了與Orlic不同的結(jié)論，目前對(duì)于造血干細(xì)胞不能分化成心肌細(xì)胞，學(xué)界已達(dá)成共識(shí)。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstem

2、cells，MSCs)的一些基礎(chǔ)和臨床研究均證實(shí)了MSCs能分化為心肌細(xì)胞，改善心功能[4-9]。然而，隨著研究進(jìn)展，有報(bào)道對(duì)MSCs定向分化心肌細(xì)胞的效率及安全性問題提出質(zhì)疑。因此，尋找更為安全、合理、有效的心肌修復(fù)干細(xì)胞顯得至關(guān)重要。隨著增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingCellnuclearantigen，PCNA)，5溴-2脫氧尿苷(5-Bromodeoxyuridine，BrdU)等與增殖相關(guān)的抗原、標(biāo)記物的應(yīng)用，更多

3、的實(shí)驗(yàn)證明心肌細(xì)胞存在有絲分裂，由此有學(xué)者提出了心臟內(nèi)也可能存在著心肌干細(xì)胞[10-11]。近來也有實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示心肌干細(xì)胞的存在[15-21]，然而各家報(bào)道的CSCs分離培養(yǎng)的方法和細(xì)胞的分化率不盡相同。本課題組致力于尋找一種有效的，重復(fù)性好的較為成熟的分離培養(yǎng)方法來培養(yǎng)鑒定心肌干細(xì)胞，并在體外誘導(dǎo)分化為可搏動(dòng)心肌細(xì)胞，以證實(shí)心肌干細(xì)胞的存在性及其向心肌細(xì)胞定向分化的能力。并擬在后續(xù)的研究工作中，進(jìn)一步探討心肌干細(xì)胞的增殖分化機(jī)理。

4、 目的在MessinaE等人的培養(yǎng)方法基礎(chǔ)上，建立成熟的體外心肌干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，培養(yǎng)得到心肌干細(xì)胞，并在體外誘導(dǎo)其分化為可搏動(dòng)的心肌細(xì)胞，論證心肌干細(xì)胞的存在性及分化能力。 方法1.原代細(xì)胞的獲?。盒律笾糜?5％酒精內(nèi)消毒30s，無菌操作下取整個(gè)心臟置于培養(yǎng)皿中，剪成約0.5-1mm3之小塊，DPBS液沖洗組織塊至液體澄清。然后加入0.2％胰酶2-3ml，37℃消化5min，吸出消化液并加入0.1％Ⅱ型膠原酶37℃消化

5、5min，棄去消化液，重復(fù)三次。完全移植物培養(yǎng)液(CompleteExplantMedium，CEM)洗1-2次后(成份：IMDM，10％胎牛血清，100Units/ml青霉素G，100μg/ml鏈霉素，2mmol/LL-谷氨酰胺，0.1mmol/L2-巰基乙醇)，用吸管將組織塊轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶中，鋪開勿使成團(tuán)。加入少量培養(yǎng)液(約0.5-1ml)，保持組織塊濕潤(rùn)即可。于37℃，5％CO2恒溫水浴培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約10-12小時(shí)(或過夜)。后加入

6、3-4ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。2-3天換液一次，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。 2.細(xì)胞的傳代：一周左右，細(xì)胞增殖至約鋪滿培養(yǎng)瓶，可進(jìn)行傳代，吸取并棄去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，DPBS洗約2-3次，加入0.05％胰酶-0.53mmol/LEDTA于37℃消化約3-5min，鏡下可見細(xì)胞收縮變圓，立即加入等體積培養(yǎng)液終止反應(yīng)。反復(fù)用吸管吸取瓶底液體吹打培養(yǎng)瓶壁，使附壁細(xì)胞脫落形成細(xì)胞懸液。將懸液移至離心管，于1000rpm轉(zhuǎn)速下離心5min，棄去上清，將

7、收集的細(xì)胞用心肌球生長(zhǎng)培養(yǎng)液(Cardiosphere-GrowingMedium，CGM)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)[成份：35％IMDM/65％DMEM-Ham'sF-12，2％B27，10ng/mlEGF，20ng/mlbFGF，40nmol/LCardiotrophin-1，(以上試劑均來自Invitrogen)，40nmol/Lthrombin(Santacurz)，100Units/ml青霉素G，100μg/ml鏈霉素，2mmol/LL

8、-谷氨酰胺，0.1mmol/L2-巰基乙醇]。傳代后的細(xì)胞同樣也是2-3天換液一次(半量換液)。 3.流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞：分別取原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。取40μl細(xì)胞懸液加入預(yù)先加有特異性檢測(cè)用單克隆抗體(5～50μl)的小玻璃管或塑料離心管內(nèi)，再加50μl1∶20(用DPBS稀釋)滅活正常兔血清。于4℃孵育30min，用D-PBS液2ml洗滌細(xì)胞，1000rpm×5min離心，棄上清。共2次。然后加入50μl工作濃度的

9、標(biāo)記二抗(帶熒光標(biāo)記物)，充分振搖，并于4℃孵育30min，同法洗滌兩次后，加適量固定液固定，上機(jī)檢測(cè)。 4.免疫組化檢測(cè)心肌結(jié)構(gòu)蛋白：組織塊培養(yǎng)進(jìn)行約一周左右，見細(xì)胞生長(zhǎng)良好，可采用前述方法制成細(xì)胞懸液，種于6孔板上。培養(yǎng)1-2天后，直接在6孔板內(nèi)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色觀察心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)。同樣方法比較傳代兩周后細(xì)胞的免疫組化染色。染色方法采用的是鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP法)。 結(jié)果1.從消化后殘

10、留心肌組織塊中成功培養(yǎng)出原代細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定其表型為c-kit，CD31陽性CD34，CD45，CTnT陰性。 2.細(xì)胞經(jīng)傳代并使用含CT-1，凝血酶等成份的培養(yǎng)液培養(yǎng)兩周后，單個(gè)細(xì)胞開始出現(xiàn)搏動(dòng)，亦可見成團(tuán)細(xì)胞的同步收縮。再次流式鑒定的結(jié)果，表型有所改變，主要是CD31轉(zhuǎn)陰性，CTnT陽性，而c-kit，CD34，CD45無明顯變化。 3.免疫組化證實(shí)，原代細(xì)胞并不表達(dá)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白CTnT，而在部分傳代細(xì)胞內(nèi)