支氣管肺泡干細(xì)胞的鑒定、分離及其微RNA表達(dá)譜的初步研究.pdf

1、目的：我們擬從肺干細(xì)胞入手，首先，通過雙重免疫熒光染色技術(shù)鑒定臨床肺癌組織和鼠正常肺組織中DPCs的存在；以此為基礎(chǔ)，分離、鑒定小鼠的DPCs細(xì)胞(即BASCs)；流式細(xì)胞儀分選出BASCs；微陣列技術(shù)檢測BASCs的miRNAs表達(dá)情況，并應(yīng)用實時定量熒光PCR技術(shù)(quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qRT-PCR)進(jìn)行驗證；生物信息學(xué)初步預(yù)測所選miRNAs的功能及其作用靶點，

2、最后通過熒光素酶報告基因載體進(jìn)行驗證。本研究以臨床肺癌組織發(fā)現(xiàn)具有干細(xì)胞表面分子標(biāo)志的DPCs細(xì)胞為基礎(chǔ)，進(jìn)一步以肺干細(xì)胞特征性miRNAs為突破點研究小鼠正常肺干細(xì)胞發(fā)生惡性突變的分子機制，不僅鑒定了正常小鼠肺干細(xì)胞的miRNAs表達(dá)譜，而且為后續(xù)深入探討miRNAs調(diào)控干細(xì)胞自我更新和分化及肺干細(xì)胞向肺癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)變的分子機制奠定了基礎(chǔ)。 方法： 1.雙重免疫熒光染色法鑒定人肺癌組織內(nèi)CCA+SP-C+細(xì)胞(DPCs)

3、：取人的正常肺組織、肺鱗癌、肺腺癌的癌組織和其各自對應(yīng)的癌旁組織，冰凍切片，進(jìn)行雙重免疫熒光染色，通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察肺內(nèi)是否存在DPCs細(xì)胞。每例標(biāo)本觀察時鏡下隨機選擇4～6個視野，計數(shù)100個肺細(xì)胞，得出每百個細(xì)胞內(nèi)DPCs百分率，采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。 2.小鼠BASCs的培養(yǎng)鑒定和分選：取成年鼠(小鼠、大鼠)、新生鼠(小鼠、大鼠)的正常肺組織，雙重免疫熒光染色法鑒定BASCs。采用膠原酶和

4、分散酶聯(lián)合消化小鼠肺組織制備肺單細(xì)胞懸液，經(jīng)免疫磁珠分選Sca-1+細(xì)胞；膠原蛋白預(yù)先包被培養(yǎng)板；無血清乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)Sca-1+細(xì)胞；雙重免疫熒光染色CCA和SP-C鑒定BASCs；通過流式細(xì)胞儀分選CD45￣CD31￣Sca-1+CD34+細(xì)胞(即BASCs)，CD45￣CD31￣Sca-1￣CD34￣細(xì)胞作為對照。 3.小鼠BASCsmiRNAs表達(dá)譜的鑒定：將分選出的細(xì)胞常規(guī)提取RNA后，經(jīng)YM-100(Mill

5、ipore)微離心過濾柱抽提小于300核苷酸長度的小RNA；微陣列法檢測BASCs和其對照細(xì)胞的miRNAs表達(dá)譜，篩選出差異miRNAs；構(gòu)建miRNAs特異性TaqManMGB探針，qRT-PCR法驗證所選差異miRNAs在兩種細(xì)胞的表達(dá)；生物信息學(xué)初步預(yù)測被選miRNAs的功能及其作用靶點(WEE1基因)；最后通過熒光素酶報告基因載體進(jìn)行驗證。 結(jié)果： 1.CCA+SP-C+細(xì)胞(DPCs)存在于人肺腺癌組織中：通

6、過雙重免疫熒光染色法在人的肺腺癌組織、正常肺組織中首次發(fā)現(xiàn)了DPCs，而在鱗癌組織中未見DPCs；在人的肺癌組織中DPCs數(shù)量明顯多于相對應(yīng)的癌旁組織(P＜0.05)。 2.建立了小鼠BASCs的鑒定、分離和培養(yǎng)方法：在成年鼠和新生鼠的正常肺組織中均發(fā)現(xiàn)了BASCs，其主要定位于BADJ區(qū)；通過膠原酶和分散酶聯(lián)合消化小鼠肺組織，平均每只成年小鼠可得到有核細(xì)胞總數(shù)為1.6～1.8×107；經(jīng)磁珠分選后的細(xì)胞其表面分子Sca-1+表

7、達(dá)的陽性細(xì)胞百分率明顯高于未經(jīng)分選的肺單細(xì)胞(87.3％±5.9％vs9.6％±1.8％，P＜0.05)；在無血清乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中Sca-1+細(xì)胞在第6天可形成BASCs克隆和其他未知的細(xì)胞克??；在有血清的條件下BASCs可分化為AT2細(xì)胞；流式細(xì)胞儀檢測CD45￣CD31￣Sca-1+CD34+細(xì)胞占肺細(xì)胞總數(shù)的0.7％～1.1％，根據(jù)此分子標(biāo)記能夠分選出純度約98％的BASCs。 3.建立了小鼠BASCs的miRNAs表

8、達(dá)譜：從BASCs和對照細(xì)胞中分別提取小RNA220ng和720ng，微陣列法檢測miRNAs的表達(dá)并比較差異；以對數(shù)(log2)為差異倍數(shù)，比較BASCs和其對照細(xì)胞，共發(fā)現(xiàn)116個miRNAs的表達(dá)具有顯著性差異(P＜0.01)，其中有56個miRNAs在BASCs高表達(dá)，60個miRNAs在BASCs低表達(dá)。在這些差異miRNAs中選取了10個與細(xì)胞周期、干細(xì)胞分化、腫瘤發(fā)生相關(guān)的miRNAs，即：miR-142-3p，miR-4

9、51，miR-106a，miR-142-5p，miR-15b，miR-20a，miR-106b，miR-25，miR-486和miR-497；通過qRT-PCR法檢測其在BASCs和對照細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示在BASCs中miR-497高表達(dá)，而其余9個miRNAs即miR-142-3p，miR-451，miR-106a，miR-142-5p，miR-15b，miR-20a，miR-106b，miR-25，miR-486在BASCs中低

10、表達(dá)；qRT-PCR的檢測結(jié)果與miRNAs芯片檢測結(jié)果一致。生物信息學(xué)初步分析所選差異miRNAs的作用靶點和功能。隨后，我們選取了在BASCs高表達(dá)的miR-497，通過miRNAs靶基因預(yù)測軟件(TargetScan、MiRbase、miRanda)預(yù)測其作用靶點，取所有3個軟件均預(yù)測到的Weel做為靶基因，最后通過熒光素酶報告基因載體驗證預(yù)測靶基因的準(zhǔn)確性(熒光素酶驗證預(yù)測靶基因的實驗尚在進(jìn)行中)。 結(jié)論： 本研

11、究首次在人的肺腺癌組織中發(fā)現(xiàn)了DPCs，而且證實了DPCs在鼠肺中存在的廣泛性；初步建立了小鼠DPCs(即BASCs)體外克隆培養(yǎng)體系；通過微陣列法鑒定了小鼠BASCs的miRNAs表達(dá)譜，與對照細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)116個miRNAs的表達(dá)具有顯著性差異(56個高表達(dá)，60個低表達(dá))；初步證實miR-497可能通過靶基因Weel調(diào)控BASCs的自我更新和分化。本課題不僅為深入研究miRNAs調(diào)控小鼠肺干細(xì)胞的自我更新和分化建立了實驗平臺，而