人水通道蛋白4重組質(zhì)粒的構(gòu)建及在HKE293細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá).pdf

1、目的:視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitisoptica，NMO)，又名Devic綜合征，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（centralnervoussystem，CNS）一種嚴(yán)重的特發(fā)性炎癥性脫髓鞘性疾病，主要表現(xiàn)為單相或復(fù)發(fā)病程的視神經(jīng)炎和橫貫性脊髓炎。典型特征為病情反復(fù)發(fā)作，預(yù)后較差。NMO的發(fā)病機(jī)制尚不明確。在北美，非白種人口中NMO患者比例比經(jīng)典MS(multiplesclerosis,MS)患者的高。在亞洲，視神經(jīng)脊髓型MS是一種常見(jiàn)的炎

2、性脫髓鞘疾病，在日本它大約占MS的5-40％。亞洲的視神經(jīng)脊髓型MS和西方的NMO是同一疾病實(shí)體嗎？很多呈現(xiàn)NMO初期癥狀的患者被誤診為MS，但這兩種疾病的預(yù)后和最佳治療方案不同。NMO的臨床表現(xiàn)較MS嚴(yán)重且預(yù)后差。第一次發(fā)病后的5年內(nèi)，約50％的患者需要協(xié)助行走，約62％的患者至少一只眼睛失去功能性視力甚至失明，約15-30％的患者死于高頸段脊髓炎誘發(fā)的呼吸衰竭和腦干參與的致命性自主神經(jīng)失調(diào)。免疫抑制藥物被認(rèn)為是NMO的最佳治療，而免

3、疫調(diào)節(jié)藥物是目前推薦的用于早期MS的有效治療。直到NMO-IgG被發(fā)現(xiàn)，其靶抗原為CNS中的水通道蛋白4(AQP4)。AQP4自身抗體的檢測(cè)在NMO和MS的鑒別診斷中可能發(fā)揮重要作用，Wingerchuk新修訂的NMO診斷標(biāo)準(zhǔn)更把其作為支持診斷的一個(gè)重要指標(biāo)，但AQP4自身抗體檢測(cè)的低敏感性和特異性仍是待解決的重要問(wèn)題。
　　本研究試圖構(gòu)建人AQP4的重組質(zhì)粒，并檢測(cè)其融合蛋白在人胚腎細(xì)胞系（HEK293）中的表達(dá)，為日后檢測(cè)NM

4、O患者血清中的AQP4抗體提供一種高敏感性和特異性的實(shí)驗(yàn)方法，初步將NMO和MS鑒別開(kāi)來(lái)，使臨床治療更具有針對(duì)性和個(gè)體化，并可進(jìn)一步深入挖掘NMO的可能發(fā)病機(jī)制，為疾病活動(dòng)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)歸的預(yù)測(cè)提供有意義的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、人AQP4基因的獲取
　　1.1引物設(shè)計(jì)合成:參照Genebank公布的人AQP4基因序列，分別設(shè)計(jì)其上下游引物，上游引物含NheⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物含XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以內(nèi)參β-肌動(dòng)

5、蛋白(β-actin)作為陽(yáng)性對(duì)照。
　　1.2腦組織中總RNA的提取:腦組織取自河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)患者，采用Trizol法提取其總RNA，提取產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并測(cè)定其純度和濃度。
　　1.3RT-PCR擴(kuò)增AQP4基因:利用隨機(jī)引物將總RNA反轉(zhuǎn)錄為eDNA，再以cDNA為模版，利用AQP4特異性上下游引物將cDNA擴(kuò)增為DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定和純化。
　　2、重組質(zhì)粒的

6、構(gòu)建
　　AQP4亞型a和空質(zhì)粒pEGFP-N1分別以限制性內(nèi)切酶NheⅠ和XhoⅠ雙酶切過(guò)夜，鑒定酶切產(chǎn)物并回收純化。將酶切純化的AQP4和pEGFP-N1用T4連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞——大腸桿菌DH5α，在硫酸卡那霉素抗性LB平板培養(yǎng)過(guò)夜，同時(shí)以轉(zhuǎn)化pEGFP-N1作為對(duì)照。挑取單克隆后擴(kuò)大培養(yǎng)，然后用質(zhì)粒提取試劑盒抽提重組質(zhì)粒。
　　3、重組質(zhì)粒的鑒定
　　3.1酶切鑒定:將獲得的重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒

7、分別進(jìn)行單酶切和雙酶切，所得產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后是否可切出完整AQP4基因。
　　3.2測(cè)序鑒定:將獲得的重組質(zhì)粒送上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中人AQP4序列進(jìn)行比對(duì)。
　　4、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、鑒定及篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株
　　4.1HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前一天，將合適數(shù)量的細(xì)胞接種至24孔板，常規(guī)培養(yǎng)至70％～80％細(xì)胞融合，通過(guò)Lipofectamine2000介導(dǎo)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到

8、HEK293細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-N1為對(duì)照。
　　4.2檢測(cè)綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá):轉(zhuǎn)染48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染處理組的GFP表達(dá)情況。
　　4.3轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選:轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)24h后觀察瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)將800mg/L的G418加入培養(yǎng)液，兩周后篩選出穩(wěn)定表達(dá)株，觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染率。聯(lián)合應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選提高穩(wěn)定轉(zhuǎn)染率。
　　5、鑒定AQP4在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)

9、>　　分別采用RT-PCR、WesternBlot、間接免疫熒光法鑒定AQP4在HEK293細(xì)胞中的基因和蛋白水平的表達(dá)情況，進(jìn)一步將固定的細(xì)胞置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，確定穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株融合蛋白是否具有膜定位效應(yīng)。
　　結(jié)果:
　　1、RT-PCR擴(kuò)增人AQP4基因:RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖可見(jiàn)清晰的特異性擴(kuò)增條帶，與理論預(yù)期值相符。
　　2、重組質(zhì)粒的鑒定:重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后在理論

10、預(yù)期值處可見(jiàn)一特異性條帶，單酶切產(chǎn)物未見(jiàn)條帶;測(cè)序結(jié)果與理論序列符合率大于99％。
　　3、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定及篩選:重組質(zhì)粒組可見(jiàn)GFP表達(dá)且熒光主要位于細(xì)胞膜上，空質(zhì)粒組可見(jiàn)GFP表達(dá)且熒光主要位于包漿中，未轉(zhuǎn)染處理組未見(jiàn)GFP表達(dá);G418抗生素聯(lián)合流式細(xì)胞儀篩選使穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率達(dá)90％以上。
　　4、鑒定AQP4在HEK293細(xì)胞中的表達(dá):RT-PCR檢測(cè)AQP4的表達(dá):RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定，在972b

11、p處可見(jiàn)一條特異性條帶;WesternBlot檢測(cè)AQP4的表達(dá):在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞中提取的蛋白經(jīng)WB檢測(cè)分析，在61KD的位置出現(xiàn)特異性條帶，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞未見(jiàn)特異性條帶;間接免疫熒光法檢測(cè)AQP4的表達(dá):熒光顯微鏡下觀察進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)后的轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞，藍(lán)光激發(fā)時(shí)細(xì)胞表面呈綠色熒光，綠光激發(fā)時(shí)細(xì)胞表面呈現(xiàn)為紅色熒光，兩者于細(xì)胞膜位置重合良好;AQP4-GFP融合蛋白的細(xì)胞定位:激光共聚焦顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)綠